[发明专利]一种病毒通用PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种病毒通用的PCR检测方法。

背景技术

近年来，传染病日益严重，且传染途径复杂，病原变异性大，这些毫无疑问都给临床检测带来了巨大挑战。传统的病原检测方法如通过临床症状、病理变化、病毒分离、人工致病试验等试验诊断病原，血清分离、电镜观察等，工作量大，技术复杂，耗时长，不适宜现在传染病的有效监测和防控。这就需要一种快速灵活的方法来检测病原核酸，以严格控制传染病的发生。

1990年，美国学者Welsh与Williams等分别同时建立了一种能够应用于不同的病原微生物的临床诊断技术。Welsh等将随机引物与PCR技术相结合、建立了用于杂交基因组DNA指纹分析的任一引物PCR方法(arbitrary primer，AP PCR)，Williams等创造了名为随机扩增DNA的多态性PCR的方法(random amplified poly morph DNA，RAPD)，两种方法区别在于前者的引物较长，多为20个左右碱基的单条或双条引物，而后者多选用9～10个碱基的单条引物。后国际上统称其为随机PCR技术。

随机PCR技术因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而迅速渗透到分子生物学研究领域的各个方面，在建立后的短短几年内，它已在微生物、植物、动物及人类研究等领域显示出广泛的应用前景。

随机PCR技术是指在实验室检测中不知样本病原序列的情况下，利用一系列的随机引物，在PCR反应体系中，首先在不严格条件下使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。理论上，不一定要求整个引物都与模板复性，而只要引物的一部分特别是3’端有3-4个以上碱基与模板互补复性，既可使引物延伸，一旦在两条单链上相距一定距离且有反向复性引物存在，则可在Taq DNA聚合酶的作用下进行DNA片段的扩增，经一至数轮不严格条件下的PCR循环后，再于严格条件下进行扩增。经对PCR扩增产物回收克隆后测序已检测病原的一种检测技术。

随机引物是指使用非特异序列的寡聚核苷酸(长度为5～10个碱基)作DNA合成过程中的引物，它与一般常用引物的区别在于其随机性或是与特异性相对的概念，包括两方面的含义：(1)核苷酸的排列顺序是随机的；(2)所有引物的的序列无直接相关性；(3)随机引物可用于所有物种。

而后，由于国际各类传染病以病毒性传染疾病最为严重，为更快、更好的检测病毒感染样品，国内外研究者对随机PCR技术进行了大量改进，建立了多种病毒检测PCR方法。

1991年，Reyes G R和Kim J P于建立了非依赖性基因扩大法(SISPA)，该方法在DNA模板钝末端连接一非对称引物，经过若干循环的变性、退火和延伸后，模板的数量得到扩增，后经克隆、测序、分析得到基因序列。Allander T、Zhang T等人采用SISPA技术测定了未知DNA及RNA病毒的序列，研究证实应用这一方法对于不同类型和来源的病毒均有效果，所获得的病毒全基因序列大小从3000bp-15kb不等，但该方法所得产物杂质较多，容易扩增到宿主染色体序列。随后Allander T、Breitbart M、Jones M S、v an derHoek L等人在SISPA基础上，应用DNase处理样品后再进行SISPA(DNase SISPA)，从临床样品中鉴定出牛和人的新病毒。Djikeng A等人(2008)在DNase SISPA基础上进行了新的改进，将RNase酶处理加入到SISPA技术的程序中，以清除外源RNA的污染如核糖体RNAs。2007年，Clem AL等建立了多重随机PCR，对快速监测和鉴定病毒有很强的实用性。

研究证明，目前所采用的病毒通用PCR方法可快速有效的检测临床上未知病原感染样品，对生产、传染病监测具有重大意义；但该方法存在一定的局限性，因为来自宿主的染色体DNA相对含量较高，对病毒样品的质量要求高，且由于该方法的可重复性不高，应用该技术直接发现或鉴定新病毒方面还没有得到很好的推广。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种病毒通用的PCR检测方法，避免宿主基因组、细菌或外源病毒感染，较好的特异性和重复性。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种病毒通用的PCR检测方法，其包括以下步骤

1)样品处理