[发明专利]肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用

说明书

技术领域

本发明涉及RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。基因组为单股正链RNA。EV71主要感染5岁以下的儿童，通过粪-口途径或飞沫进行传播，其感染主要引起手足口病(HFMD)，在临床上与柯萨奇病毒A16感染所引起的手足口病难以区别。严重的EV71感染还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹以及心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病，导致重症甚至死亡病例的发生。EV71自1969年首次由Schmidt等从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来后，已在世界范围内引起十多次的爆发和流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，令人关注的是该地区的EV71感染引起越来越严重的中枢神经系统症状。2008年和2009年以EV71感染为主的手足口病在中国大陆多个省市流行，共导致479名儿童死亡。目前尚无治疗EV71感染的特效药物，主要通过对症治疗控制病情的发展。

EV71的基因组为长约7400个核苷酸的单股正链RNA，含有一个开放阅读框(ORF)，可编码一条2193个氨基酸的多聚蛋白，包括编码结构蛋白的P1区(VP4、VP2、VP3、VP1)以及编码非结构蛋白的P2区(2A、2B、2C)和P3区(3A、3B、3C、3D)。基因组两侧分别为5’非编码区(5’-UTR)和3’非编码区(3’-UTR)，对于病毒的复制，病毒蛋白的翻译及基因组RNA的感染性具有重要作用。研究证实与EV71同属肠道病毒的脊髓灰质炎病毒，其5’-UTR区、VP1以及3C蛋白酶和3D聚合酶的编码区和3’-UTR区存在神经毒力决定位点，推测EV71的神经毒力决定簇也位于这些区域中。McMinn等通过比对1999年澳大利亚EV71流行株的VP1基因序列，发现临床症状表现为手足口病的毒株和具有神经毒性的毒株主要区别位于VP1蛋白第170位氨基酸丙氨酸到缬氨酸的替换。该位点的变化可能导致了VP1蛋白空间结构的改变，从而使病毒与宿主细胞的结合能力和病毒的毒力发生改变。2005年，Arita等通过在EV71标准株BrCr的cDNA感染性克隆中引入一系列突变，证明了在猕猴模型中，位于5’-UTR区、VP1结构蛋白和3D聚合酶编码区以及3’-UTR区的决定温度敏感性的突变位点可以减弱病毒的神经毒力。2011年，Phuektes等通过在两株细胞生长表型不同的EV71毒株的感染性克隆之间进行5’-UTR区、P1区和P2-P3-3’-UTR区的置换，证明两株病毒的生长表型差异是由P1区和P2-P3-3’-UTR区共同决定的，单一区段的对换对表型的影响并不完全匹配。许多研究也证明临床表现不同的毒株基因组序列的差异并不大，从而提示EV71的毒力决定位点并非为单一位点，可能受到多个基因组功能区域的共同影响。此外，宿主的免疫应答反应对病毒的毒力也有影响。

应用反向遗传学技术构建RNA病毒的感染性克隆，可以通过基因工程的技术手段较容易地实现对病毒基因组的改造，如定点突变、重组、缺失和嵌合等，为阐明病毒的致病机制，定位病毒的毒力决定簇、研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗候选株奠定重要的基础。

发明内容

本发明的目的是提供肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用。

为了实现本发明目的，本发明的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆，其是通过反向遗传操作获得的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆。

前述的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第930位蛋氨基酸替换为精氨基酸，或将第1152位精氨基酸替换为赖氨基酸，均不会影响其功能。

前述的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供含有上述肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆的载体。优选地，出发载体为pBR322。