[发明专利]分泌破伤风外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及分泌破伤风梭菌外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用。 

背景技术

破伤风外毒素(tetanus toxin，TT)是破伤风梭菌感染伤口后，在缺氧的条件下分泌产生的一种神经毒素，可导致患者因喉痉挛或继发严重的肺部感染而死亡，死亡率可高达20％～50％。全世界每年约有5万人死于破伤风。抗生素不能清除破伤风外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破伤风外毒素的抗体可与游离毒素结合从而阻断毒素与靶细胞的结合，因此抗破伤风外毒素的抗体是预防和治疗破伤风的首选治疗药物。 

目前临床上治疗破伤风的抗体药物：破伤风抗毒素(tetanus antitoxin，TAT)和人破伤风免疫球蛋白(human immunoglulin tetani，HIGT)存在严重缺陷。TAT系用破伤风类毒素免疫的马的血清经胃酶消化后，提纯制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂，属动物来源的异源蛋白，容易诱发人体产生严重的过敏反应甚至导致致死亡；HIGT来源于破伤风疫苗或破伤风类毒素免疫的健康人血浆，属人源性同种蛋白，不易引过敏反应，但HIGT存在免疫人血浆来源困难、产量有限、且有HIV、HBV、HCV等外源病毒污染的安全隐患，使其工业生产和临床使用受到了很大限制。目前国内外HIGT的生产均不能满足市场需求。 

基于TAT和HIGT在临床治疗和生产中存在的缺陷，研制一种能在体外规模化生产、安全、有效的新型基因工程破伤风毒素中和性单克隆抗体替代TAT和HIGT是十分必要的。 

研究表明：破伤风外毒素蛋白分子量为150kDa。毒素经菌体释放后，在蛋白水解酶的作用下，被“裂解”成一条轻链(50kDa)和一条重链(100kDa)，但轻链和重链之间仍有二硫键相连。轻链是锌依赖蛋白酶，通过水解突触囊泡蛋白-2来阻断神经抑制性介质的释放。C蛋白片段是重链的一部分，分子质量为50kDa，不具备神经毒素的活性，却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，是毒素的保护性抗原。由于C蛋白是破伤风毒素的非毒性片段，且有较高的免疫原性，因此是制备和筛选抗破伤风中和性单克隆抗体的一个理想靶标。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌破伤风梭菌外毒素单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO.C201257。 

本发明还提供一种破伤风梭菌外毒素鼠源单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO.C201257的鼠源杂交瘤细胞株产生。 

本发明还提供一种Fab抗体，其包括κ链和Fd链，所述κ链和Fd链从上述的杂交瘤细胞株的总RNA中扩增获得。其中扩增所需要的引物如SEQ ID NO：5-21所示。 

所述κ链具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种； 

所述Fd链具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。 

编码所述κ链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种； 

编码所述Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。 

根据本发明所述的Fab抗体，所述κ链的互补决定区(CDR)的核苷酸序列如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示，所述Fd的链互补决定区(CDR)的核苷酸序列如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示。 

所述κ链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示；Fd链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34所示。