[发明专利]一种鸡繁殖性状基因诊断试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，利用PCR-RFLP技术检测提供一种鸡繁殖性状相关基因——生长转化因子-9（GDF9） SNP分型的试剂盒。

背景技术

生长转化因子-9 (growth differentiation factor-9，GDF9）是转移因子-β (TGF-β) 超家族的成员之一，作为控制哺乳动物繁殖性状的主效基因或候选基因已被报道(Hanrahan at el 2004, Palmer at el 2010, Barzegari, at el 2006)。研究表明， GDF9在鸡的卵巢中特定表达，并能促进鸡卵母细胞的有丝分裂、加强颗粒细胞的增殖（Elis at el 2007），说明GDF9基因可能是控制鸡繁殖性状的主效基因或候选基因。

限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术就是利用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分型。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该技术具有特异性高、检测快速、通用性强、适用范围广、成本低廉等特点，目前已成功应用于人类疾病及禽病相关基因分子标记的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。

经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有GDF9基因多态性位点与鸡繁殖性状相关性的报道。

发明内容

本发明的目的是为了给鸡繁殖性状相关基因——GDF9基因G2051A的检测提供一种准确性高、快速、价格低廉的基因分型试剂盒，有利于筛选出产蛋数高的个体，以指导鸡繁殖性状的分子遗传标记选育。

本发明所述试剂盒包括：GDF9基因PCR扩增的上下游引物混合物、PCR反应试剂和RFLP所需试剂；所述上下游引物混合物中上下游引物为：

GDF9上游引物序列  5'-CATACAATGGTGCAGAACATAATGTA- 3'；GDF9下游引物序列  5'-ATTCTTTGTAGACTATGGAGCCATC-3'。

所述PCR反应试剂为10×buffer，dNTP，rTaq酶。

所述RFLP所需试剂为10×buffer，TaqⅠ内切酶。

本发明提供的与鸡繁殖性状密切相关基因诊断试剂盒，是直接以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，利用RFLP技术检测出GDF9的基因型。本发明操作简单、检测快速、结果准确、通用性强、成本低廉等优点。

本发明还提出以上诊断试剂盒的方法，包括下列步骤：

1）PCR扩增SNP位点所在片段；

2）PCR产物的RFLP分型鉴定。

所述PCR扩增SNP位点所在片段包括以下步骤：

1）PCR扩增反应体系准备：在PCR反应管中加入10×PCR缓冲液2.5 μL、10 μmol/L上下游引物混合物2.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL和50 ng/μL DNA模板1.0 μL，加超纯水至25 μL，充分混匀后短暂离心；

2）将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增：先94℃ 变性5min；再经过35个循环，每个循环包括94℃30s、63℃ 15s、72℃ 30s；然后72℃ 延伸10 min、最后4℃保存。

所述PCR产物的RFLP分型鉴定有以下步骤：

1）在PCR薄壁管中加入8.5μl PCR产物、2ul 10×buffer（内切酶配套）、内切酶 (TaqⅠ) 0.5ul和超纯水9 μl，充分混匀后短暂离心，然后放入37℃水浴锅中水浴6小时；

2）RFLP鉴定，酶切产物在3%琼脂糖凝胶，1×TBE，120 V电泳40分钟，用凝胶电泳成像系统显像。

本发明还在PCR扩增反应结束后，取4μl反应产物在1.5％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测扩增产物片段大小，以扩增产物片段为133 bp，判定PCR扩增片段是否正确。

本发明使用方法的优越性有： 操作简单、检测快速、结果准确，适用范围广等优点。

附图说明

图1为 GDF9基因PCR产物检测结果图。

图2为 GDF9基因PCR产物RFLP分型图。

具体实施方式

一、本发明试剂盒内容有：

1、GDF9基因PCR扩增的上下游引物混合物，