[发明专利]一种龙脑樟细胞悬浮培养液及悬浮培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及龙脑樟细胞悬浮培养方法。 

背景技术

天然右旋龙脑(天然冰片)是龙脑樟中最重要的次生代谢物质，天然龙脑是一种名贵中药材和高级香料，也是重要的化工原料，是国际市场紧俏商品，传统上，天然龙脑都是通过的提取龙脑樟树叶的方法获得。由于龙脑樟资源稀少，种源奇缺，因而，不能满足市场需求。 

现有技术中，对龙脑樟的组织培养研究主要集中在愈伤组织培养，和无性快繁体系的建立。植物细胞悬浮培养途径生产次生代谢产物是目前中药生产中的重要技术路线，但目前在龙脑樟研究中，尚无建立悬浮培养体系以提取右旋龙脑的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种龙脑樟细胞悬浮培养方法，来生产天然右旋龙脑，以解决现有技术中存在的上述问题。 

本发明提供的技术方案如下： 

技术方案一： 

一种用于龙脑樟细胞悬浮培养的培养液，包括： 

MS基本培养基 

2，4-D  1.5-2.5mg/L； 

6-BA  0.4-0.8mg/L； 

LH(水解乳蛋白)100-1000mg/L； 

椰汁0-250mg/L； 

CH(酸水解酪蛋白)500-1500mg/L；和 

蔗糖2-5％。 

更佳地，本发明采用如下的培养液：MS基本培养基+2mg/L 2，4-D+0.6mg/L 6-BA+150 mg/L椰汁+500mg/L CH+3％蔗糖。 

本发明的培养基，其PH值根据需要，可在5.0-7.0，更佳地为5.4-6.2，最佳为5.8 

技术方案二： 

一种龙脑樟细胞悬浮培养方法，包括如下步骤： 

(1)培养获取龙脑樟愈伤组织； 

(2)提供前述的龙脑樟细胞悬浮培养液； 

(3)愈伤组织在悬浮培养液中进行悬浮培养； 

(4)收获细胞，提取右旋龙脑。 

在本发明的较佳实施例中，用于悬浮培养的愈伤组织为淡白色、生长状态良好、质地疏松的龙脑樟幼茎诱导而来的愈伤组织。获得愈伤组织可以采用现有技术。继代4次后，转入悬浮培养。 

在本发明的较佳实施例中，步骤(3)的培养包括初代培养和继代培养，培养的光照强度为0-3000Lux；光照采用白光、红光或蓝光；光照方式采用连续光照方式。 

在本发明的较佳实施例中，步骤(3)的接种量为40-60g/L。 

在本发明的较佳实施例中，培养18-24天后收获细胞，提取右旋龙脑。 

在本发明的较佳实施例中，步骤(4)收获细胞的前3天在16℃条件下培养3天。 

在本发明的较佳实施例中，摇床转速为90-130r/min，最佳地，为110r/min。 

一种龙脑樟细胞悬浮培养方法，细胞悬浮培养基配方为：MS基本培养基+2mg/L2，4-D+0.6mg/L 6-BA+500mg/L LH+500mg/L CH+150ml/L椰汁+3％蔗糖，pH值为5.8；外界调控条件为：光照强度为2000Lux的白光连续照射，培养5天后置于16℃低温环境下处理3天，采用250ml的三角瓶装液80ml，接种量为40g/L·FW，摇床转速为110r/min，采用透气膜封口，培养21天收获。 

由于传统的龙脑提取方法不能满足市场需求，本发明提供了用于龙脑樟细胞悬浮培养的培养液以及培养方法。本发明以龙脑樟组培瓶苗为材料，进行优良愈伤组织的诱导，优良愈伤组织经过多次继代培养转入液体培养基，继而进行悬浮培养条件的筛选同时检测目 标产物右旋龙脑含量，从而建立了龙脑樟愈伤组织悬浮培养体系，可进一步进行右旋龙脑产业化生产。其中，采用最佳方式培养，龙脑樟细胞培养物中右旋龙脑的得率为3.81μg/g·DW。比初始愈伤组织中(2.6698μg/g·DW)的右旋龙脑含量提高了约42％。 

附图说明

图1收获时间对悬浮培养细胞生长和右旋龙脑含量的影响。 

具体实施方式

试验材料：由龙脑樟优良单株诱导而来的龙脑樟组培无菌瓶苗(高约2～5cm，一个月继代一次，继代了一年零六个月)，来自福建省亚热带植物研究所和地缘(厦门)生物科技有限公司。