[发明专利]植物内生真菌的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种植物内生真菌的分离方法。

背景技术

内生真菌是一类生长于健康活体植物组织中的特殊的真菌，它们是植物组织内的正常菌群，主要存在于表面细胞层下的组织中，而且宿主组织暂时没有症状。内生真菌与宿主长期共存，因此可能存在着能与植物宿主的遗传信息相互交换的遗传系统，具有独特的生物学和遗传学特性，能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗菌素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等。植物来源的活性物质含量一般很低，而且目前世界上的植物资源也日益减少，因此从植物中获得生物活性物质的成本很高，但若能利用植物内生真菌发酵产生活性物质，则成本必然下降，而且对保护环境、维持可持续发展亦有重大意义。因此内生真菌近年来吸引了众多学者的研究兴趣。

虽然植物内生真菌是一类大有开发潜力的微生物资源，但由于目前使用的分离条件和技术尚不完善，在分离过程中容易被外源菌污染。目前采用的组织分离法，一般是先进行表面消毒，然后用无菌刀片削去外部组织，将内部心材切割，置于含有抗生素的营养基质上，在这种分离过程中不可避免地会造成某些菌种的丢失，特别是无孢内生真菌的丢失。主要原因有：(1)表面消毒过头，将部分内生真菌杀死；(2)表面消毒不充分，表面菌污染，杂菌抑制内生真菌生长；(3)一些生长缓慢的真菌往往被生长快的真菌所覆盖；(4)所用培养基不能保证所有内生真菌都生长。

国外学者研究证明，内生真菌通常为无孢菌群，有的菌株即使进行相当烦琐费时的产孢诱导处理在人工培养基上也不产生有性或无性孢子，而目前国内所报道的内生真菌基本都是产孢菌群，且镰刀霉属、刺盘孢属、青霉属、链格霉属等的比例较高，而这些菌恰恰也是环境中比较常见的病原菌或者污染菌。因此很难证明所分离到的菌株是植物内生来源的。

发明内容

所要解决的技术问题：为了解决现有植物内生真菌的分离方法的内生真菌丢失的缺陷，本发明提供了一种新的植物内生真菌的分离方法。

技术方案为了解决上述技术问题，本发明拟采用以下技术方案分离植物内生真菌，包括以下步骤：

(1)植物样品的表面消毒：将待分离内生真菌的植物样品表面进行消毒；

(2)内生真菌的分离：将经表面消毒的植物样品置于水琼脂平板培养基上，25℃黑暗条件下培养4-7天；

(3)菌种的纯化与保藏：将步骤(2)中培养得到的菌丝纯化，即为植物内生真菌，并于4℃保藏。

步骤(1)中，所述待分离内生真菌的植物样品由植物样品的采集及保存步骤制得，选用健康植物进行采集，采集部位包括树枝、茎干、树皮、叶、花或整体果实，所述树枝和茎干长度不低于10cm，所述树皮面积不低于3cm×3cm，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的植物样品，将其存放无菌袋中于4℃保存。

步骤(1)中，所述待分离内生真菌的植物样品为软质样品，所述软质样品包括花、叶、树皮、块茎或整体果实等可以在无菌工作台内用解剖刀片轻易切割的样品；将软质样品洗净，以有效氯含量为10％的次氯酸钠水溶液浸泡3min，无菌水洗涤3次，再以体积百分比为70％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水洗涤3次；将样品边缘部分去除，内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块。

步骤(1)中，所述待分离内生真菌的植物样品为硬质样品，所述硬质样品包括树枝等在无菌工作台内用解剖刀片不能实现切割的样品；将硬质样品切成1cm长的组织块，洗净，以质量体积百分比为0.2％升汞水溶液浸泡1min，无菌水洗涤3次，再以体积比为70％的酒精水溶液浸泡1min，无菌水洗涤3次。

步骤(2)中，所述水琼脂平板培养基的配方为每1000ml水中含有20g琼脂。

步骤(3)中，挑取步骤(2)中培养得到的菌丝的尖端部分，移至马铃薯葡萄糖平板培养基上，25℃黑暗条件下培养4-7天；重复上述步骤4-5次直至得到纯菌落，即得植物内生真菌，挑取马铃薯葡萄糖平板培养基上的植物内生真菌的尖端部分移至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，25℃黑暗条件下培养4-7天，于4℃保存；所述马铃薯葡萄糖培养基配方的制备方法为200g马铃薯加水煮沸30min，过滤即得马铃薯汁，加入20g葡萄糖及20g琼脂加热溶解，补足1000ml水即得。

有益效果：本发明通过水琼脂平板培养基对植物样品中的内生真菌进行分离，建立与宿主植物内环境类似的生态模型，从而较为真实地反映植物内生菌的生物学特征，通过这种方法分离得到的无孢内生真菌的比例显著高于目前普遍采用的抗生素平板分离法。