[发明专利]一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法

权利要求书

1.一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

柳枝稷叶片的处理：

采集一月或半年的不同时期柳枝稷叶片，用体积分数为70%~80%酒精将叶片表面擦拭干净后，用蒸馏水冲洗干净，晾干;

用干净的刀片将柳枝稷叶片上表皮轻轻刮去，将其剪成0.5 mm的细丝，放入烧杯中；

酶解：

首先将上述处理过柳枝稷叶片的在预质壁分离液中避光静置处理1~1.5h，用移液枪将液体吸出，用质壁分离缓冲液将叶片清洗三次；用10~15ml酶液将叶片没过，避光条件下，置于28℃摇床，转速20 r/min，酶解2~2.5h；之后在避光条件下，静置12~14h；

过滤：

酶解后，依次用40目、100目滤网过滤溶液，之后将滤液分装入1.5 ml离心管中;

离心清洗

800 rpm离心8~10 min，弃上清;

用质壁分离缓冲液清洗3遍;

收集沉淀，即为原生质体。

2.根据权利要求1所述的一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法，其特征在于其中步骤（2）中所述的预质壁分离液中每L中含有0.4~0.5 mol的甘露醇和8~10 mmol的 CaCl₂；其中所述的质壁分离缓冲液每L中含有6~7 mmol CaCl₂，0.4~0.5mol 甘露醇。

3.根据权利要求1所述的一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法，其特征在于其中步骤（2）中所述的酶解液每100ml含有3~4g 纤维素酶，0.2~0.3g果胶酶， 0.6~0.7 mmol CaCl₂，0.04~0.05mol 甘露醇配制，pH=5~6。