[发明专利]一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法

说明书

技术领域

本发明属于悬浮细胞系技术领域，具体地说涉及柳枝稷叶片原生质体的分离方法。

背景技术

原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有活力的“裸露细胞”，由于原生质体没有细胞壁，则可以在很多方面在人工控制下进行处理，如细胞融合、细胞杂交、基因控制、遗传转化等，是基因转化的理想受体。植物原生质体培养是细胞融合的前提，可以被用来克服远缘杂交中某些障碍，更广泛地组合植物的各种有利的遗传性状，并且可用于细胞器移植和细胞突变体筛选，是植物生物技术研究的重要组成部分和基础性工作，已成为植物品种改良的新途径。

酶解法游离原生质体于1960年获得成功到现在的40多年中，由于在原生质体分离、培养、融合和转化等的研究中所取得的迅速进展，已使植物原生质体研究成为植物组织和细胞培养中最为活跃的研究领域之一。目前，在高等植物中，有关原生质体分离及植株再生的研究报道已有很多，其技术方法也比较成熟，而关于柳枝稷叶片原生质体的报道相对较少，虽然也有一些关于柳枝稷原生质体分离的相关报道，但大部分都是从花序中游离出来的，从叶片中游离出原生质体鲜有报道。

柳枝稷（英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn）属于禾本科，黍属，是一种多年生的优良牧草，在我国已有悠久的栽培历史。近几年来，因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐贫瘠，生物学产量高，可利用低质地或荒漠化土壤，被国际上确定为替代粮食资源以生产燃料乙醇的首选生物能源植物。作为一种重要的新型生物能源植物，已经成为基因转化的主要目标之一。其中，采用转基因技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光和效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点并展示出良好的应用前景，而高效游离出有活性的原生质体是整个遗传转化的基础。

目前对柳枝稷原生质体的游离方法大多集中在对柳枝稷花序的研究，从叶片游离原生质体的方法很少，而从叶片中游离出原生质体不受柳枝稷生长周期的限制，无论是一个月期还是半年期的叶片均能游离出有活性的原生质体，无疑是更便捷的方法。然而，柳枝稷叶片含有大量的纤维素且叶片较硬，又成为分离原生质体的最大障碍。

本发明提出的高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法，对柳枝稷转基因技术有重要意义。本发明通过叶片游离出有活性的原生质体，不受柳枝稷生长周期的制约，且操作简便，提取原生质体质量高，为进一步培养再生植株奠定了基础。

发明内容

本发明涉及柳枝稷叶片原生质体分离方法，有效地从叶片中分离出具有活力的原生质体。

一种高效分离柳枝稷叶片原生质体的方法，按照下述步骤进行：

1）柳枝稷叶片的处理：

采集不同时期柳枝稷叶片（一月、半年），用体积分数为70%~80%酒精将叶片表面擦拭干净后，用蒸馏水冲洗干净，晾干。用干净的刀片将柳枝稷叶片上表皮轻轻刮去，将其剪成0.5 mm的细丝，放入50ml烧杯中；

2）酶解：

首先将上述处理过柳枝稷叶片的在预质壁分离液中避光静置处理1~1.5h，用移液枪将液体吸出，用质壁分离缓冲液将叶片清洗三次；用10~15ml酶液将叶片没过，避光条件下，置于28℃摇床，转速20 r/min，酶解2~2.5h；之后在避光条件下，静置12~14h；

3）过滤：

酶解后，依次用40目、100目滤网过滤溶液，之后将滤液分装入1.5 ml离心管中。

4）离心清洗

800 rpm离心8~10 min，弃上清。用质壁分离缓冲液清洗3遍。收集沉淀，即为原生质体。

其中步骤（2）中所述的预质壁分离液中每L中含有0.4~0.5 mol的甘露醇和8~10 mmol的 CaCl₂；其中所述的质壁分离缓冲液每L中含有6~7 mmol CaCl₂，0.4~0.5mol 甘露醇；

其中步骤（2）中所述的酶解液每100ml含有3~4g 纤维素酶，0.2~0.3g果胶酶，0.6~0.7 mmol CaCl₂，0.04~0.05mol 甘露醇配制，pH=5~6。

 

本发明的优点在于：1、操作简单、便捷，易于操作。

2.设备和培养要求条件低

3.原生质体得率高、活性强。

3、不受柳枝稷生长周期限制。

附图说明

图1、2是一月期叶片游离出原生质体。

图3、4是半年期叶片游离出原生质体。

具体实施方式