[发明专利]化合物泽泻醇A的制备方法及其具有致肾毒性作用的应用

权利要求书

1.具有致肾毒性作用的化合物泽泻醇A的制备方法，其特征是：

（1）制备泽泻乙醇提取液

取泽泻，加入其重量3~5倍的70%~95%乙醇，冷浸10~15 h，加热回流提取4~6 h，过滤，反复2~4 次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 ℃蒸干溶剂，得泽泻乙醇提取液的浸膏；

（2）制备氯仿萃取物

将泽泻乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各2~4 次，合并氯仿萃取液，经旋转蒸发仪 50℃ 蒸干溶剂，得到氯仿层萃取物；

（3）化合物泽泻醇A的纯化

取氯仿萃取物，硅胶柱层析（200 ~ 300 目），用二氯甲烷-甲醇按照1:0，50:1，40:1，20:1，10:1，7:1，4:1，2:1，1:1，0:1的梯度洗脱，其中，按50:1洗脱得到的流分Fr.73～Fr.80 (Fr.为“流分fraction”的缩写，Fr.73～Fr.80指柱层析分离所得组分中第73至第80个组分) 先经过进一步的硅胶柱层析，再经Sephadex LH 20（葡聚糖凝胶）凝胶柱层析，得到的流分经制备型高效液相分离纯化，得到无色粉末状化合物泽泻醇A。

2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)中乙醇的体积分数为80%。

3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)中乙醇的加入量为泽泻重量的4倍。

4.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)中冷浸时间为12h。

5.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)中回流提取时间为5h。

6.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)中加热回流次数为3次。

7.如权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(2)中萃取次数为3次。

8.权利要求1所述的泽泻醇A的体外肾毒性试验方法，其特征是：

（1）使用MTT法测定泽泻醇A和马兜铃酸对HKC细胞的增殖抑制作用

取对数生长期的HKC细胞，将细胞密度调整至7×10³个/孔埋入96孔培养板，培养24 h后，加入受试样品（调整其浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml），每个浓度设置三个复孔，同时设置空白对照孔，置于37 ℃、含5 % CO₂的细胞培养箱中继续培养至24、48及72 h，每孔加入15 μl MTT(5 mg/ml)和85 μl 培养液，继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，微量振荡器振荡10 min将结晶完全溶解，酶标仪492 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)，根据以下公式分别计算不同浓度受试样品对HKC细胞的增殖抑制率：

增值抑制率(%)=[A_492(control)-A_492(test)]/A_492(control)×100

IC₅₀值由LOGIT法计算得出；

（2）Hoechst 33342-PI荧光双染法观察细胞形态学变化

取对数生长期的HKC细胞，将细胞密度调整至7×10³个/孔埋入96孔板，培养24 h后，加入受试样品（调整其浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/ml），作用24、48和72 h后，按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒说明书进行Hoechst 33342和PI双染，荧光显微镜下观察细胞形态变化。

9.化合物泽泻醇A具有致肾毒性作用的应用。