[发明专利]化合物泽泻醇A的制备方法及其具有致肾毒性作用的应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及具有致肾毒性作用的化合物泽泻醇A的制备方法、泽泻醇A对人肾小管上皮细胞株（HKC）体外细胞毒作用的应用。

背景技术

泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.)Juzep.的干燥块茎。首载于《神

农本草经》，历版《中国药典》均有收载。为临床除作为利水渗湿性中药，还被用作药膳、减肥保健品中，这使得它们得以被长期服用。近年来，泽泻在临床上虽广泛应用，人们只关注它的治疗功效，却忽略了其长期使用或过量使用后对肾脏造成的毒性作用，为临床安全用药留下隐患。现代临床实践与药理实验仅限于对中毒现象的描述，而其致肾毒性作用的物质基础却不甚明确，目前，对于泽泻肾毒性的研究仅限于临床报道和初步的毒理学研究，对于毒性物质基础的研究却鲜有报道。因此更需要确认泽泻致肾功能损伤的毒效部位物质基础。在中药单体化合物的毒性研究方面，学术界虽然取得了一些进展，但由于纯品化合物的分离，结构鉴定以及量的富集需要一定的前期研究，以动物进行整体水平的实验成本较高，因而在某种程度上受到限制。体外细胞毒试验不仅减少实验动物数量和受试药物的用量，缩短试验周期，而且可缩小动物种属间的差异。尤其是源于人类组织细胞的体外试验模型，消除了动物与人类的种属差异，同时可在短期内得到试验结果，降低研发成本，有助于在细胞和分子水平阐明药物毒性作用机理。人肾小管皮上细胞株（HKC细胞）源于人肾小管上皮，具有肾小管上皮细胞特有的结构和功能，能表达肾小管特异性标志酶，且存活时间长、易于传代培养。

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发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种化合物泽泻醇A的制备方法及其具有致肾毒性作用的应用。

本发明所用的泽泻来自辽宁省沈阳市中药饮片厂，所用的70%~95%乙醇指乙醇的体积分数为70%~95%。

一、作为已知化合物的泽泻醇A的制备方法

1.制备泽泻乙醇提取液

取泽泻，加入3~5倍的70%~95%乙醇（即泽泻和乙醇的重量比为1：3~1：5），冷浸10~15h，加热回流提取4~6h，过滤，反复2~4 次，合并滤液，经旋转蒸发仪 50℃ 蒸干溶剂，得泽泻乙醇提取液的浸膏。

2.制备氯仿萃取物

将泽泻乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各2~4次。合并氯仿萃取液，经旋转蒸发仪 50℃ 蒸干溶剂，得到氯仿层萃取物。

3. 化合物泽泻醇A的纯化

取氯仿萃取物，经硅胶柱层析（200 ~ 300目），用二氯甲烷-甲醇按照1:0，50:1，40:1，20:1，10:1，7:1，4:1，2:1，1:1，0:1的梯度洗脱。其中，按50:1洗脱得到的流分Fr.73～Fr.80 (Fr.为“流分fraction”的缩写。Fr.73～Fr.80指柱层析分离所得组分中第73至第80个组分。) 先经过进一步的硅胶柱层析，再经Sephadex LH 20（葡聚糖凝胶）凝胶柱层析，得到的流分经制备型高效液相分离纯化，得到无色粉末状化合物泽泻醇A。

将得到无色粉末状化合物其进行质谱结构鉴定，结果如下

无色粉末（三氯甲烷），M⁺=490，¹HNMR（CDCl₃）：δ1.00（3H，s），1.06（3H，s），1.07，1.14，1.22，1.27（3H each，s），1.02（3H，d，J=6.9Hz），1.66（1H，ddd，J=412，913，13.9Hz， Ha-22），1.75（1H，d，J=10，6Hz，H-9），2.79（1H，dd，J=5.8，13.2Hz，H-12），3.00（1H，brs，H-24），3.77（1H，dd，J=3.5，9.3Hz，H-23），3.88（1H，ddd，J=5.9，10.7，10.7Hz， Ha-11）。¹³CNMR：C₁→C₃₀，δ30.9，33.7，220.7，46.9，48.5，20.5，34.4，40.4，49.5，36.9，69.8，34.4，137.6，56.9，30.5，29.1，135.4，23.0，25.6，28.2，20.1，40.0，69.4，77.6，74.1，27.6，26.4，29.5，20.0，24.3。