[发明专利]泽泻致肾毒性作用毒效部位及其制备方法

权利要求书

1.泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物。

2.制备权利要求1所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物的方法，其特征是：首先将泽泻加入其重量8~12倍量的水，室温冷浸过夜，加热煮沸1~3次，每次提取0.5~2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到泽泻水煎液提取物；其次，将浓缩后水煎液提取物，用氯仿等体积萃取2~4 次，合并萃取液，经旋转蒸发仪50 ℃，蒸干溶剂，得到氯仿萃取物。

3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于水的加入量为泽泻重量的10倍。

4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于加热煮沸次数为2次。

5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于提取时间为1h。

6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于萃取次数为3次。

7.确认权利要求1所述的泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物的试验方法，其特征是：采用病理切片的方法，具体是

（1）制备权利要求1所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物；

（2）供试液的制备

取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液；

取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min 后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度0.5 g/ml作为阳性对照溶液；

（3）动物分组及给药方法

按体重随机将动物平均分为3组：正常对照组，泽泻氯仿萃取物组和关木通阳性对照组，将大鼠放入代谢笼适应 7 天后每天灌胃一次，连续灌胃 120 天；

（4）病理切片

于给药120天后将大鼠处死，肾脏称重，并取大鼠的肾组织用10％甲醛固定，石蜡包埋并作薄切片，制成 3 μm 切片，经苏木精-依红染色，在光学显微镜下观察形态学变化。

8.确认权利要求1所述的泽泻致肾毒性作用毒效部位是泽泻水煎液的氯仿萃取物的试验方法，其特征是：采用代谢组学的方法的方法，具体是

（1）制备权利要求1所述的泽泻水煎液的氯仿萃取物；

（2）供试液的制备

取得到的氯仿萃取物，加水稀释至相当于药材浓度2 g/mL，作为氯仿萃取物供试液；

取关木通粉碎，加入4倍蒸馏水，浸泡30 min 后，加热至沸腾，煎煮60 min，倾出药液，过滤，反复煎煮2次，合并药液，过滤，浓缩至相当于药材浓度0.5 g/ml作为阳性对照溶液；

（3）动物分组及给药方法

按体重随机将动物平均分为3组：正常对照组，泽泻氯仿萃取物组和关木通阳性对照组，将大鼠放入代谢笼适应 7 天后每天灌胃一次，连续灌胃 120 天；

（4）生物样品的采集

尿液收集：采用代谢笼法，于给药120 天收集24 h尿液至离心管中，尿样13000 rpm离心3 min 后，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存备用；

血清收集：于给药120天眼眶采血，置于试管中，放置30分钟，取出血饼，溶液13000 rpm离心5 min，分离得到血清置于-20 ℃冰箱中保存备用；

（5）代谢组学生物样品的预处理

尿样预处理：取尿样 200 μL，置于 1.5 mL EP 管中，加入 200 μL甲醇，涡旋 3 min，13000 rpm条件下离心 5 min，取上清液5 μL进行UPLC-MS分析；

血清样品预处理：取200 μL血清加入1.5 mL EP管中，加入 400 μL乙腈沉淀蛋白，在4 ℃的低温环境中，15000 rpm离心10 min，上清液转移至另一EP管中，保持30 ℃恒温，在N₂气流下吹干，用100 μL 乙腈–水(15 : 85, v/v)复溶，超声 3 min，涡旋 1 min，13000 rpm离心5 min 后，取上清液5 μL进行UPLC-MS分析；

（6）UPLC-MS分析方法的建立

色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈ 柱 6；柱温：35 ℃；流动相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱 ；

质谱条件 离子源 ESI 正离子全扫描模式，毛细管电压 3.2 kV，锥孔电压 30 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂温度 350 ℃，脱溶剂气N₂和锥孔气N₂流速分别设置为600和50 L/h；采用全扫面扫描方式，扫描范围为100 ~ 900 amu，在运用提取离子多级质谱扫描时，氩气作为碰撞气；NaCsI被用来在实验前作为质量校正；

UPLC-MS分析方法的确证 尿样和血样分析方法的精密度和稳定性考察均符合要求；

（7）数据处理

本研究运用Markerlynx软件进行色谱峰识别以及峰匹配，并采用主成分分析法（PCA）对各组大鼠血浆和尿样的代谢物组进行分析。