[发明专利]一种含LoxP-FRT重组酶位点的植物双元表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种含LoxP-FRT重组酶位点的植物双元表达载体。

背景技术

随着技术的发展，新的植物遗传转化方法在不断增加。但在众多的植物遗传转化方法中，对农杆菌介导的转化方法研究的最多，机理最为透彻。农杆菌介导的转化因操作简单、费用低廉等独特优点，成为植物遗传转化的首选。根癌农杆菌介导的方法是获得稳定的植物遗传转化的方法之一。

根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，是植物病原菌，可以引发植物产生冠瘿瘤。农杆菌能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒的T-DNA区整合到植物基因组中。这是自然界中将外源DNA转入植物细胞的天然方法。Ti质粒T-DNA区段的左右两端各有一个高度保守的25bp长的同向不完全重复序列（LB和RB）。在农杆菌对植物的转化中RB先进入植物细胞，随后外源基因及LB进入。原始的农杆菌T-DNA上编码的部分基因可以破坏植物细胞内源激素的平衡，干扰植物正常新陈代谢，引发植物肿瘤的形成。T-DNA的切除和转移是由Ti质粒的致毒（Vir）区基因编码的蛋白完成。

在所有的Ti质粒中，T-DNA区和Vir区是两个不同的区域。这是农杆菌介导植物转化的基础。人们利用农杆菌转化的原理，开发了植物表达双元载体系统。一个双元载体系统是由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒组成。通常实验中构建的双元载体为已去除了T-DNA中与干扰植物新陈代谢相关的基因，只含有T-DNA的两端边界序列。辅助质粒为含有Vir区段，但T-DNA缺失，完全丧失了致瘤的功能；其作用是提供Vir基因功能，激活T-DNA转移。为了使双元Ti载体能够穿梭在大肠杆菌和农杆菌中，并能自我复制，在这些质粒中常用到广谱复制原点，如pBIN19及其Ti质粒用到的pRK2。双元Ti质粒也可有两个复制原点(oris)；如pCGN系列质粒，一个用于大肠杆菌(如来自pColE1)，另一个用于农杆菌(如来自pRi)。

早期双元载体pBIN19等的T-DNA区常克隆自野生型Ti质粒（如pTiT37）。后来人们才人工合成了25bp重复结构的LB和RB片段。LB和RB之间序列常为一个选择标记基因（编码抗生素或除草剂）表达框和一些多克隆位点（MCS）。有的还含有一个用于蓝白斑筛选的缺陷型β-半乳糖苷酶基因（LacZ）。早期尽管人们已对Ti载体进行修改，但载体通常都很大（超过10kb），MCS位点少，且在大肠杆菌中拷贝数很低。离体的重组效率与质粒DNA的大小成反比。为了能满足转化大片段DNA的需要，双元Ti载体应尽量最小化。随着人们对双元载体的不断改进，这些缺陷正逐渐减少。

随着人们对转基因植物的生物安全性意识的提高，无标记转基因植物成为商业生产转基因植物发展的热点。国内外研究者陆续开发了多种有效的策略。利用Cre或Flp重组酶，在获得转基因植株后将选择标记基因去除是研究最为详细、应用最广的技术之一。虽然这些策略在删除标记基因上取得了成功，但在载体的构建过程中由于经过多次的亚克隆步骤，最终能用于目的基因工程操作的MCS变得非常稀少，妨碍了后期的基因工程操作。现在常用的植物转化双元载体（如pGreen、pCAMBIA等系列）虽然有着诸多的优点，方便基因工程操作，但其主要是为基础研究所创造，没有为后期将植物筛选标记去除做准备。这就使其在植物遗传转化商业生产应用中受到限制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种载体。

本发明提供的载体，为环状双链DNA分子，自5’末端至3’末端依次包括大肠杆菌复制起始原点ColE1、农杆菌复制起始原点Rep-ori、调节蛋白Rep表达框、T-DNA超驱动区、T-DNA右边界、T-DNA左边界和Kan抗性基因表达框。

上述载体中，所述大肠杆菌复制起始原点ColE1为序列表中序列4自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列1自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第1-589位核苷酸所示的双链DNA片段；

所述农杆菌复制起始原点Rep-ori为序列表中序列4自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；也为序列表中序列1自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列2自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；序列表中序列3自5’末端第590-1385位核苷酸所示的双链DNA片段；