[发明专利]NPM1基因的exon12突变检测用探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种NPM1基因的exon12突变的检测方法以及用于该检测方法的核酸探针和试剂盒。

目前已经发现大量与急性髓系白血病(AML)病因相关的DNA突变。目前已经报告了NPM1基因突变在成人急性髓系白血病患者体内被发现，而且与通过将NPM1基因突变与FLT3-ITD基因突变的结果结合起来考虑来进行预后预测相关(Blood.2007；109：874-885)。作为NPM1基因的突变类型，例如，记载在New Eng J Med 352：254-266，2005、Blood.2005；106：1419-1422、Blood.2005；106：3740-3746、Blood.2005；106：3733-3739、Blood.2006；108：1999-2005、Blood.2005；106：2854-2861中，根据报告病例数的多少以及发生突变的碱基序列的部位，可以举出具有代表性的突变：TypeA、TypeB、TypeD、Type7、TypeQ、Type10、TypeE、Type6。

作为检测碱基多态性的检测方法已知以下方法。

Blood.2005，106：2854-2861记载了如下方法，在PCR扩增后，进行电泳分离，再从切出的凝胶中精制扩增产物，然后进行直接测序的方法。Haematologica 2007；92：1268-1269中记载了通过DHPLC法和序列测定法进行检测的方法。

但是，上述这些方法存在以下问题：(1)由于提取扩增产物，所以有发生污染的可能性；(2)不能够进行自动化操作，而且需要对各个项目逐项进行操作，因此需要花费人力和费用；(3)进行结果分析时，需要专业知识和专业技能；(4)由于进行序列分析的检测特异性仅为20％左右，对于含有正常细胞比例较高的癌细胞，检测变得困难。

另一方面，已知如下方法：对含有突变的区域进行PCR扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行熔解曲线分析，根据熔解曲线分析的结果分析突变的方法(特开2001-286300号公报(专利文献1)、特开2002-119291号公报(专利文献2))。关于探针的设计，这些文献给出了以下的启示：在末端部使用荧光染料标记了的淬灭探针与靶标核酸探针进行杂交时，在末端部分，探针-核酸杂交体的多个碱基对中至少一对形成G和C碱基对。但是，这些方法在实施方面存在无法对全部的任意序列进行实施的问题。

发明内容

本发明的课题在于，确定一种有效检测NPM1基因的exon12突变的探针，并提供NPM1基因的exon12突变的检测方法以及用于该检测的试剂盒。

本发明人发现通过基于含有NPM1基因的exon12突变的特定区域设计探针，并使用该探针进行熔解曲线分析，能够检测相应的突变，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)多态性检测用探针，其为用于检测NPM1基因的exon12突变的探针，其特征在于，所述探针为由选自下述的P5、P5’、P6、P6’、P7、P7’、P1、P1’、P2和P2’中的至少一种荧光标记寡核苷酸构成，

(P5)寡核苷酸：具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P5’)寡核苷酸：具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，并且与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P6)寡核苷酸：具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P6’)寡核苷酸：具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第145位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P7)寡核苷酸：具有与序列编号2所示的碱基序列中的、含有编号145～156的碱基的12～50碱基长的碱基序列互补的序列或者与其同源的序列，与编号第153位的碱基对应的碱基为鸟嘌呤、与编号第154位的碱基对应的碱基为胸腺嘧啶，与编号145的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；