[发明专利]麻疹病毒和风疹病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。 

技术背景

麻疹是由麻疹病毒引起的全身发疹性急性呼吸道传染病，传染性强，易引起暴发流行，是危害儿童生命健康及其严重的传染病之一。在疫苗可预防的疾病中，麻疹仍然是死亡例数最多的病种。WHO已将麻疹列为无脊灰地区下一个消除的疾病，WHO西太平洋地区所有成员国承诺2012年消除麻疹，我国卫生部组织制定了《2006-2012年全国消除麻疹行动计划》。近年来随着计划免疫工作的开展，在麻疹减毒活疫苗普遍应用后，不但存在症状典型的麻疹，还存在症状不典型的病人，后者需根据实验室检测做出诊断。风疹是由风疹病毒引起的急性呼吸道传染病，可引起风疹和先天性风疹综合症(CRS)。风疹是干扰麻疹诊断的重要因素。有数据显示，在麻疹阴性标本中风疹所占的比例超过了40％。 

麻疹、风疹一年四季均可发生，但以冬末春初为多。自20世纪60年代麻疹疫苗及后来风疹疫苗使用以来，麻疹、风疹的流行规律发生了很大的变化，发病年龄后移，症状轻微或不典型，易与其它发热出疹性疾病混淆，因此实验室诊断成为科学鉴别麻疹、风疹的重要手段。 

麻疹、风疹都有很强的传染性，为了有效的保护患者和易感人群。应做到早发现、早隔离、早诊断、早治疗。这使麻疹与风疹的检测方法显得尤为重要。由于传统的麻疹和风疹检测方法如血清抗体ELISA法和细胞培养 法，用于快速诊断低滴度病毒携带者存在一些缺陷。ELISA法检测敏感度低，假阴性高，细胞培养费时费力，不利于快速检测，并且涉及活病毒的培养，对于操作人员来说具备一定的危险性。近年来针对病毒核酸序列的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。另外，我们针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性。 

发明内容

为了更加准确地检测样品麻疹病毒和风疹病毒核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中麻疹病毒和风疹病毒的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为： 

P1：5`-GAAAGGTCAGTTCCACATTGGC-3`， 

P2：5`-AACCGCTCTACTGATCCTGTCC-3`， 

P3：5`-CGCCGCACGGACAACT-3`， 

P4：5`-CTGATTGCCGGTGTAATTCATAAT-3`。 

引物的序列可分别向5`和3`端方向延伸5个核苷酸。 

P1和P2为针对麻疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P3和P4为针对风疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。 

本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为： 

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-GGATGCAAGGCTTGTTTCAGAGATTGC-Y<sub>1</sub>-3`， 

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-GAGGTCCAGGTCCCGCCCGAC-Y<sub>2</sub>-3`。 

X₁和X₂为荧光报告基团，Y₁和Y₂为荧光淬灭基团。Probe1为针对麻疹病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对风疹病 毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。 

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶和逆转录酶M-MLV，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。 

本发明的一优选实施方案为：序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为Hex，荧光淬灭基团Y₂为Eclipse。