[发明专利]烟草曲茎病毒卫星启动子

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草曲茎病毒卫星启动子。具体地说，本发明涉及烟草曲茎病毒alpha卫星分子的Rep ORF启动子分离、鉴定。本发明也涉及含有连接异源基因的烟草曲茎病毒alpha卫星的Rep ORF启动子的载体盒的构建。另外，本发明也涉及用含有烟草曲茎病毒alpha卫星的Rep ORF各种启动子的表达载体进行瞬间表达的方法。

背景技术

植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达。而适合的启动子是外源基因有效表达的关键因素。研究启动子对我们了解生物的生长发育过程、探讨生物对其生长环境的适应机制以及更好地控制外源基因在转基因植物中的表达等具有重要意义。

目前，已有许多不同来源的启动子被用于植物品质改良基因工程、抗病育种基因工程以及植物生物反应器等不同基因工程领域。这些启动子中一大类是从农杆菌中分离出来，另一大类为植物本身来源的启动子。但是由于上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，以及与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性，所以在植物遗传转化中通常选用植物病毒启动子。花椰菜花叶病毒(CaMV）的35S启动子被广泛应用于双子叶植物的遗传转化，而从木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)分离的启动子也是一种高效表达的启动子。利用鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和CsVMV启动子区以及CaMV 35S启动子的激活序列(as1，as2)人工构建高效融合启动子，瞬时表达实验表明该启动子可驱动报告基因不管在双子叶植物烟草还是在单子叶植物玉米都能高效表达。但是也不得不注意到由于上述启动子驱动的外源基因在整株植物中表达产生大量的异源蛋白或代谢产物，可能会打破植物原有的代谢平衡，而有些产物对植物并非必需甚至有的具有毒害作用，因而会在一定程度上阻碍植物的正常生长。

双生病毒(geminivirus)是植物病毒中唯一具有孪生颗粒形态的单链环形DNA病毒，病毒粒子为双联体结构，大小约为18nm×30nm，无包膜。基因组为单组份或双组份结构，大小为2.5-3.0kb（千碱基对），由昆虫介体以持久性方式传播，大多数侵染寄主植物的韧皮部组织。菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)双生病毒是一类具有经济重要性的病毒，越来越多的单组份begomoviruses被鉴定，并且多数伴随有beta卫星，一些情况下还伴随有alpha卫星。双生病毒基因组结构较为简单，但是其转录过程非常复杂，不同双生病毒间启动子的活性及表达类型有很大差异，因此对于外源基因的表达具有潜在的应用价值。目前国内外有关双生病毒启动子的研究大都针对其辅助病毒组份，对beta卫星启动子的报道仅有三例，而迄今为止尚未见对alpha卫星启动子研究的报道。alpha卫星分子是与某些单组份双生病毒相伴随的卫星分子，该分子大小约1.3kb，是其辅助病毒基因组的一半左右。alpha卫星分子单独即可复制，但需要辅助病毒才能进行装配、包裹、在植物体内运动或被昆虫传播。除含有一个高度保守的基因间隔区(IR)和一个富含腺嘌呤的A-rich区外，其基因组中编码一个与矮缩病毒(nanovirus)类似的复制相关蛋白（Rep），已有实验表明alpha卫星分子可以作为表达载体进行遗传操作。本发明的开展一方面通过了解复制相关蛋白Rep启动子的活性，可以深入了解相关蛋白的表达强度，并且能反映该表达载体的表达效率。另一方面，通过比较不同长度Rep启动子的活性大小，能够为植物基因表达提供一些有价值的表达元件，并为解析alpha卫星分子的致病性机理奠定良好的分子生物学方面的基础。基于此，本发明鉴定了烟草曲茎病毒相伴随的alpha卫星分子中Rep ORF的不同长度启动子表达活性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种烟草曲茎病毒卫星启动子。

烟草曲茎病毒卫星启动子：所述启动子DNA序列为烟草曲茎病毒alpha卫星分子的Rep ORF的缺失启动子SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示DNA序列。

DNA构建体包括烟草曲茎病毒alpha卫星分子的Rep ORF的缺失启动子SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因。

利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗病毒基因或其他抗微生物基因的方法包括如下步骤：