[发明专利]一种固定化L-天冬酰胺酶反应器

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化L-天冬酰胺酶反应器。

背景技术

L-天冬酰胺酶是一种从Escherichia coli中提取的一种药物，应用于治疗急性淋巴细胞白血病（Krejci O,Starkova J,Otova B,Madzo J,Kalinova M,Hrusak O,Trka J(2004)Leukemia 18:434-441）。自1967年，L-天冬酰胺酶就作为治疗儿童急性淋巴细胞白血病的重要组成药物。这种酶可以水解血清中的L-天冬酰胺导致细胞凋亡和损害蛋白质的合成。但是这种酶作为药物存在严重的副作用，包括肾脏毒性、过敏反应、胰腺炎及中枢神经毒性等，并且会降低凝血因子的合成。为了避免这些副作用，L-天冬酰胺酶可以进行化学修饰，包埋或固定于载体上。其中采用将酶固定于某种材料并且建立体外循环系统（ESS）具有较好的优势。ESS系统是将L-天冬酰胺酶固定于柱体、中空纤维或血液透析膜等（Jackson JA,Halvorson HR,Furlong JW,Lucast KD,Shore,JD(1979)J.Pharmacol.Exp.Ther 209:271-274），然后血液流过酶反应器酶解血清中的L-天冬酰胺再流回体内，实现疾病的治疗。这种方法不需要将药物注入体内，因此可以避免副作用的发生。而为了适应这种方法的发展，需要寻找并建立新的生物相容性良好、低毒性的酶固定化材料。

在过去的几十年中，酶固定方法可以克服游离酶在酶反应过程中的众多缺点，可以快速、高效和高通量的进行酶解研究。许多新发展的材料已经被应用于酶的固定化，比如硅材料(Rao KS,Rani SU,Charyulu DK,Kumarb KN,Lee BK,Lee HY,Kawai T(2006)Anal ChimActa 576:177-183)、纳米颗粒(Mukhopadhyay K,Phadtare S,Vinod VP，Kumar A,Rao M,Chaudhari RV，Sastry M(2003)Langmuir 19:3858-3863)、碳纳米管(Wang S,Chen Z,Yang PY，Chen G(2008)Proteomics 8:1785-1788)及其它表面固定材料已经被应用于酶固定。因此寻找新的生物相容性好的酶固定化材料成为生物传感和生物医药领域的研究热点。

发明内容

针对传统的固定化酶的载体比表面积小，且容易造成酶失活，储存稳定性差等缺点，本发明提供了一种新型的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器及其制备方法。

本发明所提供的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液混匀，室温搅拌0.5-5小时（优选1小时），然后置于2-8℃静置反应12-24小时（优选24小时），得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液；

2）制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱；

3）将所述L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液流经步骤2）处理后的毛细管并与其内壁充分接触，在2-8℃放置反应12-24小时（优选24小时），利用巯基与纳米金的反应使L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体固定于毛细管柱内壁，得到纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器。

其中，步骤1）中所述纳米金溶液中纳米金的平均粒径为13-22nm。本发明中的纳米金可采用柠檬酸三钠法制备得到。

所述L-天冬酰胺酶溶液的浓度为4.5-225.0U/mL。

L-天冬酰胺酶活力测定：在规定条件下，每分钟催化L-天冬酰胺水解释放1μmol氨的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

在制备L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体时，需保证L-天冬酰胺酶相对于纳米金是过量的。

当采用如下方法制备纳米金溶液时，所述纳米金溶液与上述L-天冬酰胺酶溶液的体积比可为1:1-1:5。

纳米金溶液制备方法：将氯金酸（1.0mM，10.0mL）煮沸后，快速加入1.0mL新配制的柠檬酸酸三钠（38.8mM）溶液中，加热同时快速搅拌，溶液变为墨绿色，进而变为酒红色，再继续搅拌10分钟，用三蒸水稀释3倍后，即得到待用的纳米金溶液。

步骤2）中制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱的具体方法如下：1）将毛细管内壁进行活化；2）将巯基硅烷偶联剂与甲醇按照体积比1:4-1:1进行混合（优选1:4），将混合溶液流经活化后的毛细管并与其内壁充分接触，然后室温放置反应12-24小时（优选12小时），得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱。