[发明专利]一种植物组织培养技术的研究方法

权利要求书

1.一种植物组织培养技术的研究方法，其特征在于：采用植物原生质体材料设定不同的外部环境条件参数，以钙离子荧光探针法测定胞内钙离子浓度变化产生的特定信号并通过获得的数据判断该种植物组织培养适宜的参数。

2.如权利要求1所述的植物组织培养技术的研究方法，其特征在于：所述特定信号是指不同种类、不同浓度的植物营养物质或植物生长调节剂作用于植物组织或细胞后，该植物细胞内钙离子浓度变化情况(即Ca²⁺振荡频率，对于相同细胞或特定刺激剂来说，反应是相对恒定的，如同细胞的指纹)。

3.如权利要求1所述的植物组织培养技术的研究方法，其特征在于：还包括将植物清洁后制成原生质体，均匀点样于不同种类和梯度植物激素设置细胞板培养室内，2min后观测荧光变化，并用数字共聚焦显微镜或显微荧光分光光度计技术测定10min内Ca²⁺浓度变化特征；将Ca²⁺浓度升高幅度设置为“0——100nmol/L，101——200nmol/L，201——300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”，从而获得该种植物组织培养的培养基配方和培养条件参数。

4.如权利要求1所述的植物组织培养技术的研究方法，其特征在于还包括如下步骤：

(1)选取植物新鲜材料中的叶、茎尖、根尖等细胞活力强的植物组织器官，清洗、酶法或机械法获得原生质体；

(2)根据实验设计，在细胞培养板上设置不同种类和梯度的营养物质和植物激素；

(3)将原生质体加入Fura22AM母液(1mmol/L，用无水DMSO配制)至终浓度20μmol/L，混匀于25℃避光孵育30min，缓冲液洗涤多次后用点样器均匀添加至各培养小室；

(4)将细胞培养板放在数字共聚焦显微镜的载物台上，用数字比率荧光测定系统观察装载了Fura22AM的细胞质游离钙离子荧光，分别采用340nm和380nm激发，用Metaflour软件控制扫描和数据采集系统，以图像和数据记录[Ca2+]i的变化。测定后软件处理可得到340nm/380nm的荧光强度比值(R)，根据公式计算：[Ca²⁺]i＝Kd(Fd/Fs)(R-Rmin)/(Rmax-R)式中Rmax和Rmin分别为最大和最小的荧光比值；Fd和Fs分别代表Ca²⁺为零和饱和状态下，在380nm波长测得的荧光强度，Kd值是指示剂与的Ca²⁺解离常数。

(5)将Ca²⁺浓度升高幅度设置为“0～100nmol/L，101～200nmol/L，201～300nmol/L，300nmol/L”以上四个区间，分别对应评判标准“不显著，较显著，显著，极显著”。