[发明专利]基于碳纳米材料的免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测和分析领域，具体涉及一种基于碳纳米材料（碳点）的免疫分析方法。

背景技术

免疫分析因其独有的特异性，在临床诊断和环境检测等方面得到广泛利用。在免疫分析诸多的检测方法中，化学发光检测方法因其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析快速和自动化程度高等优点得到重视。目前常用的化学发光免疫分析的常用标记可以分为三类。其一，化学发光物质直接标记。该类物质主要有酰肼类化合物（例如鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物）、吖啶酯及其衍生物、和咪唑类化合物。鲁米诺及其衍生物必须在适当的催化剂存在下才可以观测其化学发光反应。吖啶酯及其衍生物在双氧水的引发下可直接完成瞬时发光；但吖啶酯的稳定性及吖啶酯衍生物的制备是限制该标记物广泛应用的因素。其二，使用酶对免疫试剂进行标记。因以酶所用底物作为发光剂，故可将其归类于化学发光免疫分析。目前常用的酶标记物有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等。在免疫试剂的标记和保存过程中需考虑酶活性保持等问题。其三，纳米材料标志物。纳米材料是指三位空间尺寸中至少有一维处于纳米数量级的材料。因其尺寸处于纳米级别，使其具有特殊的光电性质。在免疫分析中，常用的纳米材料标记物有金属纳米粒子、CdTe和CdSe等半导体量子点、荧光二氧化硅纳米球、和纳米稀土荧光配合物材料等。卢建忠研究小组使用纳米金作为标记物，在免疫反应之后用溴水等氧化物质将其氧化成三价金离子，利用其对鲁米诺发光体系的催化作用进行检测[A.P.Fan et al.,Anal.Chem.,2005,77:3238]。李等利用硝酸和盐酸将金纳米离子溶解后，用于发光体系[Z.P.Li et al.,Anal.Chim.Acta,2005,551:85]；方法需要引进毒性较大或氧化性的物质，不是最为理想的。CdTe和CdSe等半导体量子点虽具有传统荧光染料试剂不具备的特点，诸如光稳定性好，发光强度高，激发光谱宽，发光光谱狭窄以及荧光寿命长等的优点，但是大多数光学性能好的量子点均含有重金属物质，存在一定的生物毒害性，其真正的应用还有很多问题需要解决。因此在化学发光免疫分析中，光学性能优异，且稳定好，无毒害作用的标记物的开发具有极其重要的意义。碳点是一类生物兼容性好，且光学性能优异的碳纳米材料。碳点在免疫分析中的应用很少；目前仅有将其作为抗体载体，用于电化学免疫分析的报道[D.Du et al.,Anal.Chem.,2010,82:2989][R.J.Cui et al.,Adv.Funct.Mater.2008,18:2197]。其优异的光学性能尚未在免疫分析中得到应用。

发明内容

本发明中，发明人合成一种具备荧光性质且光学性能稳定的碳纳米材料粒子。当其与一些氧化试剂共存时候，可以观察到很强的化学发光。通过红外表征，该材料表面具备丰富的羧基和羟基官能团，证实该材料具有很好的生物标记前景。在对该材料进行免疫试剂标记之后，利用其可以建立高灵敏且安全无毒的免疫分析方法。

本发明提供一种基于碳纳米材料（碳点）的免疫分析方法，包括如下步骤：步骤A，制备碳点并在碳点的表面标记免疫试剂抗原或抗体，使之成为免疫试剂标记碳点；步骤B，将免疫试剂标记碳点、待测样本、以及免疫试剂抗原或抗体包被的固相物质混合完成免疫反应形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离免疫试剂进行分离；和步骤C，对所述免疫复合物加入氧化剂进行化学发光检测，和/或对其直接进行荧光检测。

依据本发明，优选所述碳点为以PEG1500、甘油和丝氨酸混合制备得到。合成本发明中碳纳米材料的途径有两种。第一种，微波加热法合成：利用微波加热的方式将PEG1500和甘油先混合，在微波加热下形成透明黏稠状液体，而后加入碳源丝氨酸，利用微波对碳源进一步加热，使得试剂之间互相交联形成碳点（碳纳米材料）；第二种，水热法合成法：将PEG1500、甘油和丝氨酸放入反应釜中，密封反应釜后于250℃加热3小时即得。本发明中，所述碳点粒径优选为3~4nm，其表面带有羧基和羟基基团。3-4nm的碳点在免疫试剂上的标记对免疫试剂生物活性影响较小，且碳点材料原料无毒、环保。