[发明专利]一种生物毒素的制备方法

权利要求书

1.一种生物毒素的制备方法，其特征在于：通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C₄-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C₄-OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的藕合，藕合产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。

2.根据权利要求1所述的一种生物毒素的制备方法，其特征在于：所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下：

步骤110：取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30℃的恒温下培养24h以进行菌种活化；

步骤120：之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30℃，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4℃、10000×g条件下离心10min，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na₂CO₃裂解液中且于4℃下裂解2h，将裂解后的溶液置于4℃、10000×g离心30min，取上清液；

步骤130：用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5.0后于4℃下静置过夜，将静置后的溶液置于4℃、10000×g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于-20℃下保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种生物毒素的制备方法，其特征在于：所述阿维菌素C₄-OH处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下：

步骤210：在反应瓶中加入6.1g阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3.2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25℃下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0℃并加入60ml水终止该反应；

步骤220：接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤210已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml；

步骤230：合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品；

步骤240：用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物1，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5；

步骤250：之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁二酸酐、中间产物1及催化剂三乙胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点；

步骤260：用水和乙酸乙酯萃取步骤250所获得的溶液，取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为2:1；

步骤270：取0.3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入10ml含1.384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用乙酸乙酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最终获得4-O-琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C₄-OH处的羧基间隔臂得以构建。