[发明专利]一种生物毒素的制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种生物领域物质的制备方法，尤其涉及一种生物毒素的制备方法。

【背景技术】

农作物生长过程受到害虫的危害，农药的防治是丰收的重要措施。无论是化学农药还是生物农药，害虫对之都能产生抗药性。其发展速度之快，要求在研究上能提供对农药特别是生物农药进行结构修饰和改造的方法，对付抗药性的发展，以扩大杀虫谱和提高杀虫效果。害虫对农药抗药性就是克服农药位点作用，使之失效、钝化。在实际应用中，农药轮换施用、农药混配施用、增加农药对害虫的接触面积、培育害虫的敏感品系、增加生态多样性以增加害虫的多样性等等，实质上是使农药作用位点保持足够的敏感性，寻求克服抗性的手段。每一种农药对害虫都有一个主要作用位点，每一种害虫都存在多个农药作用位点。害虫对含有单一作用位点的农药产生抗药性比含有多个作用位点的农药容易的多。两个以上作用位点的农药称之为多位点杀虫毒素，多位点杀虫毒素的研究是克服害虫抗药性的有效途径。

生物藕合技术是形成多位点杀虫毒素的有效方法，可以应用生物藕合技术，将两个杀虫毒素联结，或增加一个或多个基团，解除害虫的抗药性，为农药及其生物农药克服害虫的抗药性提供了有力的武器，生物藕合技术在多位点杀虫毒素的构建上显示出了广阔的应用前景。

苏云金杆菌（Bacilus thuringiensis，简称Bt）是目前世界上生产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂，其晶体蛋白对570余种鳞翅目害虫及双翅目、膜翅目和鞘翅目等数十种害虫有致病性。一般认为，昆虫在取食晶体蛋白后，通过自身的中肠蛋白酶将其酶解为活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中肠上皮细胞刷状缘膜（BBMVs）上的受体结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症；虽然苏云金杆菌应用广泛，但其杀虫效果并不太理想。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物毒素的制备方法，以获得更好杀虫效果的生物毒素。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种生物毒素的制备方法，其操作如下：通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C₄-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C₄-OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白相藕合，藕合合成的产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。

进一步地，所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下：

步骤110：取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30℃的恒温下培养24h以进行菌种活化；

步骤120：之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30℃，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4℃、10000×g条件下离心10min，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na₂CO₃裂解液中且于4℃下裂解2h，将裂解后的溶液置于4℃、10000×g离心30min，取上清液；

步骤130：用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5.0后于4℃下静置过夜，将静置后的溶液置于4℃、10000×g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于-20℃下保存备用。

进一步地，所述阿维菌素C₄-OH处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下：

步骤210：在反应瓶中加入6.1g阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3.2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25℃下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0℃并加入60ml水终止该反应；

步骤220：接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤10已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml；