[发明专利]梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒及其制备

权利要求书

1.梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于设有DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶、质控品瓶和包装盒；所述DNA提取试剂瓶、耐热DNA聚合酶瓶、PCR反应液瓶、标准品瓶和质控品瓶设在包装盒内；所述DNA提取试剂瓶设有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、无水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗缓冲液瓶、洗脱液瓶、第2清洗缓冲液瓶和含收集管的离心柱；所述标准品瓶设有6个含polA基因的标准品质粒瓶；所述质控品瓶设有阴性质控品瓶和阳性质控品瓶。

2.如权利要求1所述的梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于所述耐热DNA聚合酶瓶采用Tag酶瓶；

所述6个含polA基因的标准品质粒的浓度分别为1.0×10²copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10⁴copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、1.0×10⁶copies/mL和1.0×10⁷copies/mL，共6个浓度。

3.如权利要求1所述的梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应液的成份含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和polA基因引物、探针组成的混合物；

所述耐热DNA聚合酶具有3'→5'DNA聚合酶活性、5'→3′DNA外切核酸酶活性和可耐受高温的聚合酶；所述耐热DNA聚合酶最好是半衰期>45min的高温聚合酶。

4.如权利要求1所述的梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）靶基因筛选，具体方法如下：

从基因库中筛选梅毒螺旋体polA基因，polA基因探针和引物的设计采用PCR引物探针设计软件辅助完成，然后通过Basic Local Alignment Search Tool进行同源性比对以保证其特异性，合成的引物和探针用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计进行浓度测定后，保存，所述TE为10mM Tri-HCl，pH5.0，0.1mM TA；

2）polA基因标准品质粒的构建，具体方法如下：

以硅胶膜-离心柱法提取梅毒螺旋体Nichols株DNA作为模板，采用步骤1）中的polA基因的引物，进行PCR扩增，具体过程如下：将扩增产物经过回收及纯化后，在微量离心管中配制DNA溶液，后加入5μL等量的Solution I，16℃反应30min，与pMD18-T载体连接将连接产物转化至DH5α中，冰中放置30min，42℃加热45s后，再在冰中放置1min，加入LB培养基，37℃震荡培养60min后，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，进行增殖培养，提取质粒并对其进行PCR，Xab Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切及测序鉴定后，将构建好的质粒进行单酶切线性化处理，再用紫外分光光度计定量并-20℃保存作为FQ-PCR的标准品；

3）polA基因检测试剂标准曲线制作，其具体方法如下：

包含polA基因的阳性克隆大肠杆菌在含Amp LB肉汤增菌，提取质粒，取10μL质粒用双蒸水稀释100倍，260nm，280nm比色，纯度=A₂₆₀/A₂₈₀，浓度=A₂₆₀×50×2×100×10^-6×6.02×10²³/(2806×324.5×2)copies/mL，根据质粒浓度，进行梯度稀释，以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围；

4）制备PCR反应液，其具体方法如下：

采用PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、polA基因引物、探针的混合物共同组成PCR反应液；

5）制备耐热DNA聚合酶，其具体方法如下：

大肠杆菌用异丙基硫代-β-D半乳糖苷进行诱导表达，诱导后的菌悬液100ml经5000r/min，4℃离心5min，以10ml缓冲液I重悬菌液，4℃，5000r/min，离心5min，细菌沉淀再悬于5ml缓冲液I中，加入溶菌酶使浓度达5mg/ml，37℃水浴20min；加入5ml缓冲液Ⅱ，75℃水浴45min，4℃，15000r/min离心10min；上清加入硫酸铵使达30%，4℃，1500r/min离心10min，沉淀溶于1ml缓冲液Ⅲ中，并对缓冲液Ⅲ在4℃条件下透析，每6h换液1次共4次，离心除去不溶物后，-20℃冻存；

6）建立样品处理方法，其具体方法如下：

使用梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂检测梅毒螺旋体的样本，采用硅胶膜-离心柱法提取模板DNA；

7）制备质控品，其具体方法如下：

制备阴性质控品：选择经过临床确认为阴性的临床标本；

制备阳性质控品：选择经过临床确认为阳性的临床标本经稀释获得阳性质控品；

8）制备梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒，将DNA提取试剂、耐热DNA聚合酶、PCR反应液、标准品和质控品共同组成梅毒螺旋体polA基因FQ-PCR检测试剂盒。