[发明专利]一种检测犬细小病毒的生物条形码及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及条形码检测方法，特别是涉及用于检测犬细小病毒的生物条形码检测技术所用的引物、探针及其荧光定量PCR检测试剂盒的组装。

背景技术

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教授于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的106倍。BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic microparticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针(nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的特异DNA链释放出来，通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。

NP探针即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗被检物的多克隆抗体，双链DNA其中的一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA；MMP探针即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁性微球探针，其表面包被有抗被检物的单克隆抗体。

从BCA技术的检测程序可以看出，其基本原理类似于双抗体夹心ELISA抗原检测法。通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于PCR反应和芯片检测的放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

生物条形码检测过程可以分为条形码DNA的获取和条形码DNA的检测两大方面。条形码DNA的获取过程包括三步，第一步：抗原抗体作用，先用抗被检物的单抗功能化的MMP探针特异性地结合标本中可能的被检物，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的被检物和不相关的杂质；第二步：洗脱和去杂交，加入被双链DNA和抗被检物的多抗修饰的NP探针，将被检物夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三步：DNA分离，此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下，NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放到溶液中，接着对条形码DNA链进行定量，从而间接检测被检物。条形码DNA链的检测现在有两种方式：一是对获取的条形码DNA链作普通的PCR扩增，然后凝胶电泳检测；二是通过芯片检测，芯片检测系统需要三种不同作用的核酸：1)与固相支持物(玻片等)连接的捕获探针(捕获DNA修饰的玻片)；2)产生信号的检测探针(DNA修饰的胶体金)；3)靶核酸(条形码DNA)，靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能与上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答，得到的信号可以用普通的平板扫描仪进行分析。

BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specificantigen，PSA)进行了检测，利用BCA技术检测PSA的检测下限可达3a mol/L，检测下限比现有的传统ELISA方法低6个数量级；Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，其检测极限能在15μL脑脊液中检测到50个ADDL分子；Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测结果显示检测限度可达170fmol/L。

综上所述，BCA技术与ELISA技术相比，具有非常显著的优点，具体表现在以下几个方面：1)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六个数量级(100万倍)的敏感性；2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多种物质；3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测系统使用的单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高特异性；4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。