[发明专利]基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法

说明书

技术领域

 发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，其具体是指，中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用，抑制位点的选择，T7核酸外切酶抑制分析，和基于Taqman探针的实时荧光定量检测方法。

背景技术

有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及有机小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，此方法设计简单，对DNA序列没有依赖性，仅需设计一条寡核苷酸DNA链和Taqman探针即可，在其中间抑制位点进行有机小分子标记后即可实现检测，此方法可实现多目标同时检测，并且操作简便、快速、灵敏。

本发明的技术方案是，所述基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法为：利用包含有中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后对T7核酸外切酶抑制，通过Taqman探针的荧光实时变化，定量分析检测有机小分子与蛋白的相互作用以及有机小分子或其结合蛋白。

以下对本发明作进一步说明

所述基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法包括：

(1) 包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白的相互作用及T7核酸外切酶抑制分析；

(2) 选择T7核酸外切酶抑制位点；

(3) 采用基于Taqman探针的实时荧光定量方法进行T7核酸外切酶抑制分析的定量检测。

以下对本发明做出进一步说明。

所述包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白相互作用的检测及T7核酸外切酶抑制分析采用以下步骤实现：

对于有机小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是：取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再于微量管中加入包含有机小分子结合蛋白的样品溶液；然后T7核酸外切酶以及Taqman探针反应,得抑制反应的产物；

对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取所述有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再加入包含待测有机小分子的样品溶液，混合均匀后加入有机小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入T7核酸外切酶以及Taqman探针反应，得抑制反应的产物。

T7核酸外切酶抑制位点选择与Taqman探针5端互补的有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链下游1到3碱基中的任意一个。

所述T7核酸外切酶抑制的定量检测可采用标准的Taqman 探针荧光实时定量检测。

本发明中，所述寡核苷酸DNA单链的中间有机小分子的修饰通过现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与中间碱基NH₂标记寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与中间标记有巯基的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。

进一步地，本发明中，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及T7核酸外切酶抑制分析采用以下步骤实现：

a. 对于有机小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是: 取7μL上述有机小分子修饰寡核苷酸DNA链置于微量管中，加入6μL 5×T7核酸外切酶反应缓冲溶液（40 mM Tris-HCl,50 mM NaCl,20 mM MgCl, pH 7.525℃），然后加入8μL包含有机小分子结合蛋白的样品溶液，在37℃恒温反应0.5小时，再加入3μL T7核酸外切酶和6μL Taqman 探针，置于37℃反应2h后，升温至75℃反应10min进行热灭活以终止酶反应。