[发明专利]单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物组和试剂盒

说明书

    本发明申请是专利号为：200810121029.X，专利名称为：单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法，申请日为：2008-09-16 的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm) (以下简称“单增李斯特菌”)是一种重要的人畜共患病致病菌，广泛存在于土壤、动物和水产品等，主要通过奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物传播。该菌已被列为90年代4大食品致病菌之一，成为许多国家食品卫生的必检项目。

传统的单增李斯特菌生化检测方法全过程至少需要7～10 d，检出限较低 ，费时费力。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR或荧光定量PCR方法快速，特异、灵敏度很高，但需要昂贵的PCR仪。国外曾有少量文献报道利用mRNA模板针对iap基因以RT - PCR检测活体单增李斯特氏菌，但需要以膜杂交来显示检测结果，时间长、技术复杂、费用高，不易推广应用。荧光染色技术可以对活菌进行检测，但技术复杂，需要高端仪器。因此建立一种简便、灵敏、快速、特异的方法很有必要。

环介导等温扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP）（国际专利公开号WO 00/28082）是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I 染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。

中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6）分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌的方法。但是，目前还没有用环介导等温扩增基因技术检测单增李斯特菌的试剂盒的报道。

发明内容

为了解决现有单增李斯特菌的检测方法不简便、灵敏低、时间长、特异性差的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种单增李斯特菌环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplication ，LAMP）技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒检测方法。本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异好的特点，可广泛用可广泛用于食品、水产品、化妆品与医疗卫生等领域。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用以下的技术方案：

单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，所述的引物为一套单增李斯特菌特征性引物组，一套引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物，共有六套引物，序列分别为：

引物组一：

外引物1：CAAGCACTGTAGTAGTCGA

外引物2：CGTAATAATACTGTTATCAACACC

内引物1：GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG

内引物2：ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG

或引物组二：

外引物1：GGTGATACTCTTTGGGGTAT

外引物2：CGTAATAATACTGTTATCAACACC

内引物1：GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC

内引物2：ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG

或引物组三：

外引物1：TTAAACGTCCGTACTGGC 

外引物2：CACTTCTTGTGTTGGTGC