[发明专利]一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒。

背景技术

器官移植已经成为治疗脏器衰竭的重要手段之一，但这项技术在飞速发展的同时也面临着各种挑战，其中受者自身免疫系统可识别外源性脏器，而人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen,HLA）是器官移植发生免疫排斥的最主要原因。

受者作为生物有着一种天赋的能力和机构-免疫系统，它能对进入其体内的外来“非己”组织器官加以识别、控制、摧毁和消灭。这种生理免疫过程在临床上表现为免疫排斥反应，导致移植器官破坏和移植失败。移植器官正像人的其他细胞一样，有二大类主要抗原：ABO血型和人类白细胞抗原（HLA），它们会造成同种异体移植的排斥反应。ABO血型主要有4种（O型、A型、B型、AB型），寻找ABO血型相同的供受者并不难，但是HLA异常复杂，现已查明有7种抗原类型，即HLA-A、B、C、D、DR、DQ、DP，共148个抗原，其组合可超过200万种。事实上除非同卵双生子，否则不可能找到HLA完全相同的供受者。所以，同种异体移植后必然存在发生排斥反应的风险，但如果供受者HLA高度相同，免疫排斥反应发生的程度会较轻，因此，移植前需要对供受者匹配程度进行充分评估，以降低移植排斥的风险。供受者微量淋巴毒试验（Micro-complement dependent cytotoxicity test,CDC），即检测供者淋巴细胞的杀伤率，以此来推断出受者是否可以接受供者的器官进行移植。

CDC，从字面上直译为微量补体依赖的细胞毒性试验，在国内普遍称为微量淋巴毒试验。其检测原理是补体与抗体的Fc段结合后，补体系统被激活，在靶细胞表面形成MAC（膜攻击复合物），MAC在细胞膜上形成亲水性穿膜孔道，能使水和电解质通过，而不让蛋白质类大分子逸出，最终可因胞内渗透压改变，而使细胞溶解破坏，从而介导细胞杀伤效应，这种效应即为补体依赖的细胞毒作用。但是，这种传统CDC方法在受者血清滴度较低的情况下容易产生假阴性反应或疑似阴性反应，使检测结果出现较大误差，灵敏度较差。同时，传统CDC方法使用台盼蓝染色统计淋巴细胞死亡率，这种依靠单一染色方法进行结果统计容易因人为经验而造成较大误差，进一步降低了CDC方法的准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒，使得该检测方法能够提高灵敏度和准确度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种荧光原位微量淋巴毒检测方法，将受者血清和供者淋巴细胞混匀孵育，使受者血清中IgG抗体的Fab段与供者淋巴细胞表面抗原结合，洗板后加入由补体和抗人IgG轻链的二抗组成的混合液孵育，使所述二抗的Fab段与受者血清中IgG抗体结合，补体与二抗的Fc段结合，然后由补体介导细胞杀伤效应杀死靶细胞，接着进行荧光染色并利用计数法统计供者淋巴细胞的死亡率，所述补体和二抗的体积比为150-250∶1，所述供者淋巴细胞的存活率大于90%。

其中，所述受者血清和供者淋巴细胞孵育时间优选为30min，所述受者血清、供者淋巴细胞以及混合液孵育时间优选为60min。

传统CDC方法是通过补体与人IgG的Fc段结合从而介导细胞杀伤效应，若受者血清中抗体滴度较低，人IgG抗体Fab段与淋巴细胞表面抗原结合后，相邻的人IgG抗体Fc段之间的距离较远不足以结合补体，从而无法进一步发挥补体介导的细胞杀伤效应，致使检测出的淋巴细胞死亡率比应有的死亡率偏低，容易误判，轻者造成器官移植的失败，重者危及受者生命健康。

本技术领域公知，Ig分子的Fab段为抗原结合片段，Fc段为可结晶片段，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。而本发明针对现有技术问题，在加入补体的同时增加一种抗人IgG轻链的二抗，因此所述二抗的Fab段能够特异性的结合于人IgG的轻链，且由于人IgG具有两个轻链，所以一个IgG抗体能够结合两个二抗，形成更多的Fc段，同时使得两个二抗的Fc段之间距离较近，能够作为桥梁充分结合介导细胞杀伤效应的效应分子-补体，激活补体，启动免疫反应，从而最大程度的介导细胞杀伤效应，使检测出的淋巴细胞死亡率与应有的死亡率缩小误差，提高检测的灵敏度和准确性。