[发明专利]Tβ4-EGF融合基因的制备及其应用

说明书

  

技术领域

本发明涉及Tβ4与EGF基因的融合，Tβ4-EGF融合基因表达载体的构建以及Tβ4-EGF融合蛋白的表达。 

  

背景技术

胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)是一种重要水溶性多功能酸性肽，在人体分布广泛，其蛋白结构含有2个α螺旋结构，没有β转角结构，因此在溶液中呈非折叠状态，易于识别不同种类的蛋白及靶细胞受体，从而具有多方面的生物学活性，在许多生理病理过程中起到重要的作用，如参与炎症反应，细胞迁移，创伤愈合等。在创伤愈合过程中，Tβ4作为一种诱导因子，能与多种细胞因子和蛋白相互作用，调节其表达以促进细胞迁移和创伤愈合。经Tβ4处理过的创口会发生血管再生加速、角质形成层细胞迁移、胶原沉积以及伤口收缩等一系列反应，加快伤口的愈合速度。 

人表皮生长因子（human Epidermal Growth Factor，hEGF)，是人体内一种重要的多肽生长因子，其蛋白结构内含有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域，EGF与受体EGFR结合，能够刺激EGFR酪氨酸残基磷酸化，从而改变细胞内酸碱浓度和钙离子的浓度，促进糖酵解和蛋白质的合成，增加某些专一性基因的转录，从而促进多种组织来源的细胞增殖分化。在创伤修复过程中，EGF能够产生分裂信号和趋化信号，促进表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞增殖分化以及纤维蛋白的合成，并能够聚集创伤修复所需的蛋白和细胞，增加创口愈合的张力，促进皮肤和粘膜创伤的愈合。 

目前已有重组人EGF与白介素融合基因原核载体的构建及蛋白的表达，如EGF-IL24和EGF-IL18，也有重组人EGF和重组人Tβ4蛋白的表达及引应用，但尚无Tβ4与 EGF融合基因重组构建并表达的实例。 

  

发明内容

本发明要解决的技术问题在于通过重组PCR技术构建Tβ4-EGF融合基因，既能与EGFR结合，又能使Tβ4和EGF发挥各自的生物学活性，增强对皮肤创伤愈合的促进作用。 

为解决上述技术问题，提供一种Tβ4-EGF融合基因的制备方法，根据人Tβ4基因库序列设计引物，以插入人Tβ4完整编码区基因的质粒pET-32a为模板进行PCR扩增；在T4DNA连接酶的作用下定向连接至载体pTXB1；再以重组质粒pTXB1-Tβ4为模板，设计引物，采用两步PCR法扩增获得Tβ4-EGF融合基因，所述引物含有Nde I和Xho I 酶切位点。 

进一步地，所述所述PCR的反应条件为94⁰C预变性5分钟，95⁰C变性30秒，52⁰C退火30秒，72⁰C延伸30秒，扩增35个循环，再在72⁰C下反应10分钟，4⁰C 下反应10分钟。 

提供一种Tβ4-EGF融合基因原核表达载体的构建，将所制备的Tβ4-EGF融合基因在T4DNA连接酶的作用下定向连接至载体pTXB1，并将连接产物导入 DH5α感受态细菌。 

提供一种Tβ4-EGF融合蛋白的表达，将Tβ4-EGF融合基因原核表达载体导入感受态细菌E.coliBL21(DE3)，以IPTG诱导表达重组的人Tβ4-EGF融合蛋白。 

所述Tβ4-EGF融合蛋白的表达，将Tβ4-EGF融合蛋白经几丁质亲和层析柱纯化并DTT切割后得到纯化的Tβ4-EGF融合蛋白。 

与现有技术相比，本发明Tβ4-EGF融合蛋白以可溶性非包涵体形式存在，经几丁质亲和层析柱纯化，纯化操作简便，表达纯度高，经Tβ4-EGF融合蛋白处理后，培养的3T3细胞增殖速度加快，增殖得到促进。 

  

具体实施方式 以下结合优选实施例作进一步详述。

本发明采用PCR法扩增人Tβ4基因和人EGF基因并获得Tβ4-EGF融合基因，构建Tβ4-EGF-pTXB1重组质粒，导入感受态大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中培养，以IPTG诱导表达重组的人Tβ4-EGF融合蛋白，几丁质亲和层析柱并DTT切割后得到纯化的Tβ4-EGF融合蛋白，MTT法检测其生物学活性。具体步骤如下：