[发明专利]一种I型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种气单胞菌属产普鲁兰酶菌株普鲁兰酶编码基因的克隆。本发明还提供该普鲁兰酶编码基因重组质粒的构建和重组普鲁兰酶制备方法。

背景技术

I型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）以内切方式专一水解普鲁兰糖的α-1，6葡萄糖糖苷键，其水解产物主要是麦芽三糖（Doman-Pytka M et al.，Critical Reviews in Microbiology，2004，Vol 30，Issue 2，107-121）。除了降解普鲁兰多糖以外，普鲁兰酶还能水解淀粉和支链淀粉，因此I型普鲁兰酶具有很重要应用价值。比如：I型普鲁兰酶能够与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒中的发酵度；在食品、医药化妆品、分析化学等领域，普鲁兰酶能够逆向合成麦芽糖基-α-环糊精，相比目前广泛应用的环糊精，无任何毒性与溶血性；利用普鲁兰酶水解支链淀粉中的α-1，6糖苷键，可将支链淀粉转变成直链淀粉，后者具有很好的抗水性和成膜性，有望生产可食性包装膜，解决“白色污染”问题；除此之外，采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量，后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能。

目前，国内外分离产普鲁兰酶菌的产酶酶活较低，产酶水平一般为2～5 U/mL，且这些产酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属（巩培 et al.，天津科技大学学报，2009，Vol 24，Issue 3，10-12；Shobha M.S. et al.，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，Vol 56，Issue 22，10858-10864）。这些产酶菌株大多为病原菌，其发酵液不能直接用于工业添加，特别是食品工业，因此普鲁兰酶基因的重组表达至关重要。然而，普鲁兰酶编码基因序列通常较长（3～6 kb），这就使其重组表达变得困难重重，国内关于普鲁兰基因重组表达的报道较少。另外，淀粉加工时通常采取50～55 ℃的反应温度，这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶，具有重要的应用意义。

申请人的课题组先前从稻田土壤中筛选到一株产普鲁兰酶的气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As，其菌种保藏号为：CGMCC NO.5490，保藏日期为2011年11月28号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为3G2。

发明内容

本发明的第一个目的是提供酶活高、热稳定性好的普鲁兰降解酶编码基因。

本发明的第二个目的是提供具有活性的上述普鲁兰酶基因片段的重组质粒。

本发明的第三个目的是提供上述重组普鲁兰酶的酶学特性和功能及应用。

本发明提供的普鲁兰降解酶编码基因，是利用Aeromonas sp. As菌株（CGMCC NO.5490）所产，记为 pluAs。

本发明利用PCR技术获得Aeromonas sp. As菌株（CGMCC NO.5490）普鲁兰酶基因pluAs的全长序列，该基因全长4053 bp，编码1351个氨基酸，预测蛋白大小140 KDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列与Aeromonas hydrophia普鲁兰酶（通过对该菌株全基因组测序的方法获得，蛋白序列号：ABK37551.1）相似度为89%，表明该基因为新的普鲁兰酶基因。

本发明还提供上述普鲁兰酶全长基因（pluAs）的克隆方法，即以气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As 基因组DNA为模板，通过保守序列设计引物，进行PCR扩增（图1）。 

本发明还提供3种含有普鲁兰酶基因片段（见图2）的核苷酸编码序列的重组质粒。该质粒是pET21a-PluAs-1、pET21a-PluAs-2、pET21a-PluAs-3。将含有本发明的普鲁兰酶基因片段编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成上述重组质粒。