[发明专利]一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白Cry1Ab的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微悬臂梁检测杀虫晶体蛋白Cry1Ab的方法，具体涉及一种微悬臂梁表面修饰杀虫晶体蛋白Cry1Ab抗体的方法及应用。 

背景技术

Cry1Ab蛋白是一种源于苏云金杆菌[Bacillus Thuringiensis(Bt)]的基因表达的毒蛋白。苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,是一类对害虫毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物。菌体在稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白,又称杀虫晶体蛋白(ICP)或D2内毒素。ICP由Cry基因和Cyt基因编码,对敏感昆虫有较强毒性,而对高等动物和人无毒性。CrylAb属于Cry基因家族,是Bt基因表达的毒蛋白(Microbiol.Rev.1989,53,242)。Bt在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中已成为化学合成农药的有力替代品,它还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。对Bt蛋白快速、准确地测定,将为育种、转基因植物的虫害管理和基因标识提供技术支撑。目前常见的Bt蛋白检测方法有基于核酸DNA检测的PCR法(Anal.Bioanal.Chem.2003,373,985)和基于蛋白检测的酶联免疫吸附测定法(ELISA)(Nature,1999,402,480)，PCR法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确测定，不受样品的处理方法的影响，但容易出现假阴性和假阳性等问题，对于经过高度处理的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等，它们不含任何DNA成分，因此PCR法很难实现对此类转基因食品的检测；酶联免疫吸附检测是基于抗原和抗体的特异性结合以及酶底物的高效催化特性的一种快速检测技术，具有快速、灵敏、准确、低成本等特点，己能定性又能定量检测目标转基因蛋白。但该方法需要进行荧光标记，操作复杂。而微悬臂梁基于表面应力的改变来检测抗原和抗体的特异性结合，无需标记，操作简单，且灵敏度更高。 

微悬臂梁生化传感技术是近年来伴随着扫描探针显微镜（SPM）和微机电系统（MEMS）迅速发展起来的一种新兴技术。当有生化反应在微悬臂梁的单侧表面发生时，其表面应力的改变会导致微悬臂梁产生弯曲变形，通过光学或电学读出方法可以测量变形值（Nat.Biotech.2001,19,856;Chem.Rev.2008,108,522）。和传统的ELISA方法相比，基于抗体修饰的微悬臂梁免疫传感技术具有以下优点：无需标记、灵敏度高、容易实现实时在线的大尺度、高通量、平行阵列测量，可能潜在地用于替代现有的酶联免疫吸附检测方法，对转基因 物种的分析检测具有十分重要的意义。目前基于微悬臂梁的免疫传感器主要是用于检测PSA（Biosens.Bioelectron.,2005,20,2157）、CRP（Biosens.Bioelectron.,2004,20,269）、scFv(Proc.Natl.Acad.Sci.,2005,102,14587)、IgG（Biosens.Bioelectron.,2005,21,597）、myoglobin(Sens.Actuators,B2006,117,332)和GST(Nanotechnology,2007,18,125503)等等，但到目前为止，还没有任何专利和文献报道基于微悬臂梁的检测转基因蛋白（如杀虫晶体蛋白Cry1Ab）的方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种新型无标记、高灵敏度、高特异性的基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白CrylAb的方法。 

为解决上述技术问题，本发明开发了一种基于微悬臂梁的检测杀虫晶体蛋白Cry1Ab的方法，包含以下步骤： 

将带金膜的微悬臂梁进行前处理，浸入巯基化试剂的醇类溶液中，使巯基化试剂修饰到微悬臂梁的金膜上，清洗；所述清洗包括用乙醇清洗，氮气吹干； 

将微悬臂梁浸入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中，使巯基化试剂的羧基活化，清洗；所述清洗包括用去离子水清洗，用生物缓冲溶液清洗； 

将微悬臂梁浸入杀虫晶体蛋白Cry1Ab抗体的生物缓冲溶液中，所述生物缓冲溶液包括pH 7.4的PBS缓冲液，静置，使活化后的羧基和杀虫晶体蛋白Cry1Ab抗体的氨基结合。 

将上述修饰有Cry1Ab抗体的微悬臂梁用于对杀虫晶体蛋白Cry1Ab的检测。