[发明专利]一种玉米单倍体加倍方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及农业育种领域，更具体地，涉及一种高效低耗、能够使加倍率显著提高的玉米单倍体加倍技术。

背景技术

玉米中采用双单倍体育种(Doubled haploid，DH)可以缩短自交系选育时间，加快育种进程，已经成为玉米育种的主要方法。获得足够单倍体和加倍获得DH系是DH育种的基本环节。然而，玉米单倍体自然加倍比较困难，目前，单倍体的成功加倍是单倍体育种技术大规模应用的限制因素，尤其是雄穗的成功加倍。单倍体加倍分为自然加倍和药物加倍，许多材料的自然加倍率低于5％，有些材料甚至不发生自然加倍，因此采取人工处理提高加倍率来满足育种与相关研究的需要显得尤为重要。

人工处理加倍的方法和试剂较为多样，其中秋水仙素是常用的加倍试剂，且多采用浸芽法进行处理。因为浸芽法简单易行，而且具有较高的加倍效率。但秋水仙素的毒性很大，对幼苗易造成严重伤害，很容易影响单倍体的加倍效率。另外，整体来看，浸种法加倍效率并不理想。主要是浸种法对植株伤害较为严重，存活率较低；并且，前人所用的浸芽法都是将整个幼苗都浸泡在秋水仙素溶液中，不仅幼芽吸收秋水仙素，而且幼苗根部也吸收了大量的秋水仙素溶液，从而影响了根系的生长，造成大量幼苗死亡。

因此，探索一种既能减少幼苗死亡又能提高玉米单倍体加倍率的加倍方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于一种既能减少幼苗死亡又能提高玉米单倍体加倍率的加倍方法。

发明人通过大量实验研究，发现了一种高效低耗的植物单倍体加倍技术，包括以下步骤：1)切除植物单倍体幼芽胚芽鞘尖端；2)用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的植物单倍体幼芽的上部，得到染色体加倍的植物幼芽。上述植物单倍体加倍技术，命名为幼芽上部浸泡法。

由于在该方法中，植物单倍体幼苗仅上部(即胚芽部分)和秋水仙素溶液接触，因而受伤害相对较小，存活率得以提高，同时加倍效果也非常好，具有良好的应用价值。

本发明提供的植物单倍体加倍方法，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

优选地，所述单子叶植物为玉米。

在本发明中，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.4-0.8mg/mL，并配以1％-5％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：300-1000μl。

在本发明中，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.6mg/mL，并配以2％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：500μl。

进一步地，在本发明的方法所述浸泡步骤中，仅留胚芽部分浸泡在混合液中，根部露在外部。

进一步，本发明提供了一种高效低耗的玉米单倍体加倍方法，包括以下步骤：

1)切除玉米单倍体幼芽胚芽鞘顶端；

2)用秋水仙素配以二甲基亚砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽的上部，通过该部分浸泡措施，得到染色体加倍的玉米幼芽。

该方法中用秋水仙素混合液浸泡过程中，首先在每个离心管中加入300-1000μL 0.4-0.8mg/mL的秋水仙素溶液，所述秋水仙素溶液中还配有1％-5％二甲基亚砜，紧接着将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽根部朝上倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h。

优选地，所述的秋水仙素混合液的浓度为：0.6mg/mL，并配以2％二甲基亚砜；秋水仙素混合液的使用量为：500μl；整个操作过程要求在23℃进行，浸泡8h。

在用秋水仙素混合液浸泡过程中，为了防止幼芽根部脱水，可用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部，可达到更好的效果，实现更好的存活率。

进一步，本发明所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1.种子发芽：将单倍体种子清洗干净，均匀地摆放在铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在20-28℃的适宜环境中暗光培养3-5天，并及时补充水分。

2.胚芽鞘顶端切除：待玉米单倍体幼芽长至1-3cm时，切除玉米单倍体幼芽的胚芽鞘尖端且不损伤真叶和生长点，得到切除胚芽鞘尖端的玉米单倍体幼芽。

3.幼芽浸泡：取离心管，在每个离心管中加入300-1000μL0.4-0.8mg/mL的秋水仙素溶液(配以1％-5％二甲基亚砜)，将已经切除胚芽鞘顶端的幼芽倒着放进离心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，为了防止幼芽根部脱水，用湿纸巾或湿毛巾覆盖幼苗根部。整个操作过程要求在18-25℃之间进行，浸泡6-10h。