[发明专利]含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂

权利要求书

1.一种用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，该试剂包括三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合物，其中所述的三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白为CFP-10、ESAT-6和TB10.4。

2.权利要求1所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合比例为1~2∶1~2∶1~2。

3.权利要求2所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白的混合比例为1∶1∶1或2∶2∶1或1∶1∶2。

4.权利要求1至3中任一项所述的用于牛分枝杆菌感染检测的试剂，其中所述三种重组表达的牛分枝杆菌蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

5.用于制备牛分枝杆菌感染检测试剂的引物，其中包括3对引物，其中第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，第一引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。

6.权利要求5所述的引物在制备牛分枝杆菌感染检测或诊断试剂中的用途。

7.一种制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，该方法包括：

（a）用权利要求5所述的引物PCR扩增获得3种编码基因；

（b）重组表达步骤（a）获得的编码基因得到3种重组蛋白；

（c）将步骤（b）获得的3种蛋白按比例混合得到牛分枝杆菌感染检测试剂。

8.权利要求7所述的制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，其中步骤（a）中的3种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

9.权利要求7或8所述的制备牛分枝杆菌感染检测试剂的方法，其中步骤（b）中的重组表达的具体操作为：将含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的重组质粒PET分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ 200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ 200r/min震荡培养至OD₆₀₀ nm=0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h。6000r/min离心10min收集菌体，用40mL PBS（pH7.4）洗涤两次，10ml PBS（pH7.4）重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清，蛋白上清液经滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS（pH7.4）缓冲溶液中。

10.一种用于检测牛分支杆菌感染的方法，该方法包括（a）剃毛后测量牛颈部上1/3处皮肤厚度；（b）向测量部位施用权利要求1至4任一项所述的诊断试剂；（b）72小时后，再测皮肤厚度，并计算该部位注射前后的皮厚差；当皮厚差大于等于2毫米时，判定为牛结核阳性，反之则为阴性。