[发明专利]含重组蛋白混合物的牛结核病检测试剂

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域。本发明涉及用于牛分支杆菌感染检测的新型试剂盒及方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)感染引起的一种人畜共患的慢性传染病，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染也可引起。世界各国均有发生，危害十分严重，给畜牧业带来巨大的经济损失和贸易限制，目前世界范围内约有5000万头牛感染了结核病，每年因此损失30多亿美元。该病能通过未经巴氏消毒的奶及奶制品、接触污染的气溶胶或者动物尸体等传染给人，从而严重威胁着公共卫生安全及人类健康，因此具有非常重要的公共卫生意义。世界卫生组织（WHO）指出：“在存在牛结核病的国家，人类始终受到威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。”目前，一些较发达国家和地区，如美国、澳大利亚和北欧等已基本消灭了牛结核病。但牛结核病在我国依然是最常见的多发性疾病之一，1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别达5.83%和5.43%。近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率正逐年上升。目前我国一些省区牛结核病的发病率已达10.18%以上，甚至更高。

牛结核菌素皮内变态反应试验（GB/T 18646）为世界动物卫生组织（OIE）规定的牛结核病检验的标准方法。结核菌素又称为纯化蛋白衍生物(purified protein derivatives，PPD)，是将牛型或禽型分枝杆菌菌株接种适宜培养基培养，收获培养物，经灭活、滤过除菌、提纯或浓缩制成，其实际上是牛型或禽型分枝杆菌菌株在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，其中部分的抗原在禽分枝杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非致病性环境分枝杆菌中广泛存在，致使PPD检验的特异性较差，在实际检测时容易出现假阳性，而且PPD生产工艺复杂，生产过程中需要培养具有毒力的牛分枝杆菌，很难保证其安全性及各批次间PPD质量的稳定。

90年代后期国外发展起来的以PPD为抗原的γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）释放试验明显提高了牛分枝杆菌检测的灵敏性，其原理为：致敏的外周血淋巴细胞在体外培养过程中，通过特异抗原(如PPD)刺激后被活化，从而高水平表达并分泌IFN-γ，通过相应的技术手段对培养上清中IFN-γ的释放水平进行检测（如ELISA）从而判断其是否感染，其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性。该方法避免了对机体的侵入性实验，可以短时间内多次重复实验，同时也摒弃了结核菌素试验中操作和判断上的主观性，因此具有非常广泛的应用前景，已在澳大利亚、新西兰等国家进行了大量的田间试验，目前国外已将该类牛结核病检测试剂盒商品化，并被OIE所推荐使用，但因使用PPD作为刺激原，在实际使用过程中不可避免出现假阳性。

为了提高牛分枝杆菌检测特异性，国内外学者开始利用基因重组技术，重组表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，例如6kDa早期分泌性抗原性靶（The early secreted antigenic target6ku protein ESAT-6）、MPB-64、MPB-70、MPB-63、热休克蛋白65（Heat shock protein 65，HSP-65）、抗原85B（antigen 85B,Ag-85B）、10kDa的培养滤液抗原（10kDa culture filtrate antigen,CFP-10）等。然后，用这些重组蛋白中的一种或者多种混合（又称“鸡尾酒法”）作为包被抗原进行酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测，通过检测牛血清中相应的抗体水平进行牛结核病的血清学检测，该方法虽然一定程度上提高了检测的特异性，但其敏感性不够理想，特别是感染早期及免疫低下者常出现假阴性。

因此，研究更加敏感、特异的牛结核病新型检测抗原和检测方法，是控制牛结核病当务之急。

本发明人通过基因重组技术表达了牛分枝杆菌的多种特异性蛋白，并将其进行组合，使得刺激原克服了PPD的缺点，具有了生物安全、组分明确、含量稳定、成本低廉的优点。用多个重组蛋白进行组合作为刺激原替代PPD进行皮内变态反应实验和IFN-γ释放试验进行了反复研究，将两种方法结合，很好地提高了实验特异性的同时，也克服了单一抗原或“多抗原鸡尾酒”血清学检测敏感度不高等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供用于牛分枝杆菌感染检测的新型试剂及方法。