[发明专利]冬虫夏草菌种培养方法

权利要求书

1.一种冬虫夏草菌种培养方法，其特征在于：所述方法为将自然冬虫夏草经分离纯化、 试管斜面种、振荡器液体一级种、 二级种、 小型种子发酵种子罐、生产发酵罐、 浓缩、和喷粉干燥，得成品菌粉。

2.如权利要求1所述的冬虫夏草菌种培养方法，其特征在于，分离纯化步骤的具体要求为：

 (1)材料要求：进行冬虫夏草的组织块分离法，分离材料是每年的10月底至11月份，青藏高原高寒草甸土壤刚开始冻结时期采的材料，这个时期冬虫夏草菌刚感染蝠蛾幼虫进入僵虫期不长时间，嫩小的子座芽刚长出虫头部0.2-0.5cm，虫体内其他杂菌较少； 

(2)分离操作方法，有以下3个步骤： 

a.僵虫体 (即菌核)的分离：分离前，用水刷洗干净主体表面，再用无菌水清洗2一3次；用0.1%一0.2%的升汞溶液，对分离材料进行约3一5min的表面消毒；再用无菌水清洗；选取与胸足为界的前段部分；用解剖刀切去表皮，避开消化道，取血腔菌丝切成芝麻粒大小，压入平板培养基中，每皿1一2粒，置于15一19℃中培养，待菌落长出0.2一0.5cm时，挑选少量菌丝反复在平板培养基上分纯2一4次，确定无其他杂菌后，移入试管保存和培养； 

b.子座芽分离：从僵虫头顶切下洗净的子座芽，置入0.1%升汞液中消毒2一3min，用无菌水洗净，切取中间部位组织块压入培养基中；培养条件同a； 

c.子囊孢子分离：用透明纸袋套住子囊孢子成熟的子座，让子囊孢子弹跳粘贴在纸袋上，然后，把有子囊孢子的纸袋浸入25%的葡萄糖液中，洗下孢子，放入15一19℃中培养，每天镜检，当袍子萌发时，用微吸管吸单个孢子滴于平板中培养；培养条件同a； 

也可把整个成熟的冬虫夏草带回室内，用棉纸把僵虫和连虫体的子座包住，仅留出有孕部分，在无菌室中，横放，下置一片载玻片，随时保持主体湿度；每天镜检，当看到子囊孢子弹到玻片时，用微吸管吸到平皿的培养基中培养；培养条件同a； 

(3)培养基的选用：

a.马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)，此种配方是所有虫草菌属真菌的通用培养基，在分离培养初期可用该配方，不过菌种生长不十分旺盛，而且易老化、退化； 

b.加富培养基 (1)：多性蛋白脐10g，葡萄糖50g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，活蚕蛹30g，生长素0.5μg，琼脂20g，加水1000mL，pH：5.0； 

加富培养基 (Ⅱ)：蛋白脯40g，葡萄糖40g，去皮鲜马铃薯100g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，牛肉膏10g，生长素0.5μg，蝠蛾活幼虫 (磨碎)30g，琼脂20g，高寒草甸土浸出液10OOmL，pH：5.0；

在加富培养基上，菌落比在PDA培养基上生长旺盛和迅速；加富Ⅱ号又优于Ⅰ号。

3.如权利要求2所述的冬虫夏草菌种培养方法，其特征在于，冬虫夏草菌分离纯化后，即可作为各种实验和扩大生产应用； 

(1)其扩大生产的方法常有三种：固体静置培养法、振荡培养法和大罐通气发酵培养法； 

a.静置培养：主要用在固体培养，如试管斜面、三角瓶培养、米饭培养等等，在静置培养中只要掌握好温度和光照即可使菌正常生长；当斜面上的分生孢子成熟后，即可存入1-2℃的冰箱中保存8-14个月，也可作为种子直接用于生产； 

b.振荡培养：采用液体培养菌种或小规模繁殖培养，都可用振荡培养；振荡培养的培养基，把固体培养基减去琼脂即可；设备最好选用恒温振荡培养机，用三角瓶置液体培养基，把试管固体菌种接入即可培养；经不断振荡使液体培养基中各种成分混合均匀而不致沉淀，同时促进气体与液体接触和交换，使氧进入液体培养基中，利于菌丝生长和分生孢子形成；

c.大罐通气发酵培养：在大规模生产菌丝和分生孢子等菌粉时，必须用大罐通气发酵培养法；该方法通气是采用吸气或真空泵减压等方法，经过滤器除杂菌，送入罐内液体培 养基中供冬虫夏草菌的生长发育。

4.如权利要求3所述的冬虫夏草菌种培养方法，其特征在于，冬虫夏草菌罐中发酵要求温度在20-25℃，罐压392.3-686.5kPa，通气量为0.5-1.0VVm*；注入发酵罐中的液体培养基为罐容的65%-75%； 接种量为10%，搅拌速度为180r/min，培养时间72-96h，即可放罐浓缩和喷粉； 

发酵培养基：鲜马铃薯 (去皮)8%，蔗糖2%，玉米淀粉0.5%，蚕蛹粉1%，蛋白胨0.4%，硫酸铵0.2%，pH值5.5-6.0；

发酵培养成品标准：分生孢子即几全脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，在镜下计数检查，每毫升含分生孢子18亿-25亿个；残糖低于1%；氨基氮低于0.2mg/mL，即可成为成品菌液。