[发明专利]骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及细胞的培养方法。 

背景技术

巨噬细胞广泛分布于全身各器官、组织，在保持内环境稳定、机体防御、炎症调控、促进组织损伤修复方面起着重要作用。巨噬细胞在不同微环境下具有不同的表型，使巨噬细胞处于不同的功能状态。这些功能状态迥异的巨噬细胞在不同生理及病理条件下发挥不同的生理功能；与肿瘤、代谢综合症、糖尿病等严重疾病的发生、发展都有密切的联系。 

静息巨噬细胞在不同刺激条件下可激活分化为表型和功能迥异的两大类型：M1型和M2型。M1型巨噬细胞主要引起Th1型免疫反应，起着细菌感染防御的作用；加重炎症反应导致组织损伤。M2型巨噬细胞则主要诱导Th2型免疫反应，在防御寄生虫感染，促进组织修复和调节免疫反应方面起着重要作用。 

骨髓来源的巨噬细胞具有静息巨噬细胞的特点：即同源性好，通过不同的刺激条件可分别诱导分化为M1型(经典激活型)和M2(选择激活型)。另外，骨髓来源的巨噬细胞还具有产量高，易转染，生长周期长等优点；其他巨噬细胞的体外培养方法，如从血液、腹腔、组织中分离提取获得的巨噬细胞在体外培养。这种获得巨噬细胞的方法虽简单方便，得到的巨噬细胞往往均一性较差，产量低、存活时间短。特别是针对一些较难获得的珍贵血液或组织标本，骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养尤为重要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨噬细胞的体外诱导培养方法，该培养方法稳定性佳，能提高外诱导培养的骨髓来源的巨噬细胞的纯度。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体为将骨髓来源单个核细胞悬液在体外用培养基培养，在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单个核细胞悬液的预处理步骤，具体为：将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，取过滤液进行培养。 

进一步，所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基。 

进一步，将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，将过滤液在1000～1500rmp/min条件下离心不多于10分钟，去上清液，用含M-CSF的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备单个核细胞悬液。 

进一步，含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基中含M-CSF的浓度为20ng/ml。 

所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法的优选方案具体包括以下步骤： 

A骨髓来源的细胞混合液的制备 

用注射器吸取PBS缓冲液插入离体动物股骨两端的软骨处冲出股骨内的骨髓，收集骨髓来源的细胞混合液； 

B单个核细胞悬液的制备 

将步骤A所得的收集骨髓来源的细胞混合液混悬，得骨髓来源的单个核细胞悬液，用滤孔为70μm的滤器过滤，将过滤液在1500rmp/min条件下离心10分钟，去上清液，用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重悬细胞，制备细胞重悬液； 

C第一阶段细胞培养 

将步骤B所得细胞重悬液调节调节成浓度为1-2×10⁶个/mL，置于培养箱 中37℃、5％孵育24～30小时后，吸弃上清，另加入所述含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基，再培养48小时； 

D第二阶段培养 

在第一阶段细胞培养完成后，不超过24小时对培养的细胞进行换液，另培养3-4日，得分化成熟的巨噬细胞。