[发明专利]一种快速检测核酸病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测核酸病毒的试剂盒。

技术背景

中国有1亿3千万乙肝病毒（HBV）携带者，4千万丙肝病毒（HCV）携带者，专家预测2010年我国将有1000~1500万人艾滋病毒（HIV）携带者，这三种疾病为全球性疾患。血液是艾滋病,乙肝及丙肝的主要传播途径，保证输血安全是控制这些疾病血液传播的最有效的环节之一。纵观现代采血、输血发展历程，各种血液安全政策的实施或是重大革新技术的应用，都能明显降低因输血造成传染性疾病的传播风险。虽然第3代的酶联免疫检测技术（ELISA）的应用已经能够降低这一风险，但是感染HBV、HCV、HIV后，产生抗HBV、抗HCV、抗HIV的“窗口期”较长，在窗口期内用ELISA技术很有可能产生漏检，所以国外从上世纪末开始就采用了核酸检测（nucleic acid test, NAT）的方式来筛查血液，确保检测的准确性。

目前NAT技术主要是提高核酸探针的敏感性，从而提高检测水平。主要分为两种主要方法：1）模板扩增技术主要有聚合酶链式反应（PCR）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）、自主序列复制系统、连接酶链式反应等；2）信号放大系统，主要有分支DNA探针、3D DNA探针等。第一种模板扩增技术，需要用到相应的PCR仪或是荧光定量PCR仪，扩增所用的试剂基本依赖于国外几个大公司的试剂盒产品，价格昂贵，先期投资较大，同时检测时间长。与第二种方法比较，第一种模板扩增的方法还存在技术上的局限：1）不论是Tag酶或是逆转录AMV酶都没有3’-5’核酸外切酶的活性，容易发生碱基的错配；2）引物3’端部分配对可导致非特异性的扩增，造成假阳性；3）外源性污染也容易导致假阳性。而第二种方法核酸检测信号放大方式则是通过增加标记探针的数量或增强标记物的信号强度来提高灵敏性，不存在扩增靶序列的问题，所以其反应迅速，重复性好，依托相应的检测仪器，升级其检测功能，其临床应用潜力巨大。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供一种快速检测核酸病毒的试剂盒，其原理是利用核酸检测信号放大技术，依托相应的检测仪器，利用同时标记有罗丹明染料和报告探针的脂质体，与经分离的血液样本混匀，这样脂质体和病毒核酸靶序列通过报告探针结合。然后混合血液样本点滴于带正电荷的尼龙膜上，根据毛细作用原理，血液样本在膜上迁移，当移动至事先固定于尼龙膜上的捕获探针时，脂质体-病毒核酸复合物通过与捕获探针之间的碱基互补作用，富集于捕获探针区域，形成可分辨的红色荧光斑点，通过测定吸光值大小，根据标准曲线获得病毒核酸靶序列的含量。

一种快速检测核酸病毒的试剂盒，该试剂盒包括带正电荷的尼龙膜、报告探针、捕获探针、预杂交液和杂交液；所述的报告探针是标记在包裹有磺酰罗丹明B的脂质体上。

所述的包裹有磺酰罗丹明B脂质体的制备方法是：精密称取20.0mg蛋黄卵磷脂、5.0mg磷脂酰乙醇胺、25.0mg胆固醇溶于20mL氯仿，加入4mL 125μg/mL磺酰罗丹明B溶液，混合后水浴超声5min，制成均匀的白色乳剂，40°C水浴中减压蒸发至凝胶态，然后加入6mL水溶液，放置30min使其充分水合即得磺酰罗丹明B脂质体混悬液，储存于4°C冰箱中。

报告探针标记包裹有磺酰罗丹明B的脂质体的方法是：取合成的羧基修饰的DNA探针，加入EDC水溶液和S-NHS水溶液，室温静置。加入1 mL制备的脂质体溶液，混合，4℃下孵育。透析除去过量EDC，S-NHS和副产物脲。反应结束后4℃下离心，重复洗涤离心2次分离出游离探针，收集沉淀脂质体重悬于HEPES缓冲液中备用。

所述预杂交液配方为： 50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS，0.1%BSA，0.1% PVP，用pH7的PB调终体积；并加入鲑鱼精 DNA50μg/mL。

使用时预杂交液放入沸水中10min后放入-20℃冰箱中迅速冷却10min，备用。

所述的杂交液配方为：50%的去离子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt,s，1%葡聚糖，用蒸馏水调终体积，现用现配。

应用本发明试剂盒快速检测核酸病毒的时间可以在10分钟内完成。

具体实施方式

本发明所提到的百分比都是质量体积比，即w/v（mg//mL）

SSC：柠檬酸缓冲液

SDS：十二烷基磺酸钠

BSA：牛血清白蛋白

PB： 磷酸盐缓冲液。

实施例一  试剂盒的使用方法