[发明专利]一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法

权利要求书

1.一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合，其特征在于，所述效应细胞组合包括依次以细胞悬液形式注射入肿瘤患者体内的CIK细胞和MSC细胞，所述CIK细胞和MSC是从非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来。

2.如权利要求1所述的效应细胞组合，其特征在于，所述CIK细胞是通过以下方法获取的：

（1）血液单核细胞采集：通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56℃水浴灭活，离心后备用；

（2）CIK细胞培养：用无血清培养基调细胞浓度为4-6×10⁶／ml，加入RetroNectin和CD3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37℃、5% CO2培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFN-γ1000U/ml，IL-2 500-1000U/ml，自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞；

其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25％以上，台盼蓝染色细胞活度90％以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80％以上，细菌和热源检测合格后方可使用。

3.如权利要求1所述的效应细胞组合，其特征在于，所述MSC细胞是通过以下方法获取的：

（1）血液单核细胞采集：通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离出PBMC,收集血浆56℃水浴灭活，离心后备用；

（2）MSC培养：取部分上述分离的PBMC加入1×PBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心５分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照１×10⁶／cm^２的密度接种于75cm^２培养瓶中进行原代培养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37℃的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。

4.如权利要求1所述的效应细胞组合，其特征在于，临床使用时，单次注射所述效应细胞组合的方法为：取30-50×10⁸个CIK细胞加入100-150ml左右的含1%的人血白蛋白生理盐水中，用输血器静脉滴注，每分钟60滴为宜；取30-50×10⁶个MSC细胞加入100-150ml左右的含1%人血白蛋白的生理盐水中，用输血器静脉滴注，速度同CIK细胞悬液，先输CIK后接着输注MSC，二者之间可不用盐水冲输液管道。

5.一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）血液单核细胞采集：通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56℃水浴灭活，离心后备用；

（2）CIK细胞培养：用无血清培养基调细胞浓度为4-6×10⁶／ml，加入RetroNectin和CD3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37℃、5% CO2培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFN-γ1000U/ml，IL-2 500-1000U/ml，自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞；

其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25％以上，台盼蓝染色细胞活度90％以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80％以上，细菌和热源检测合格后方可使用；

（3）MSC培养：取部分上述分离的PBMC加入1×PBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心５分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照１×10⁶／cm^２的密度接种于75cm^２培养瓶中进行原代培养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37℃的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。