[发明专利]去甲肾上腺素完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法

权利要求书

1.一种去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，包括下述步骤，

（1）将去甲肾上腺素与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节pH值为6.0－6.5后，4℃持续搅拌下进行偶联反应20－28小时，得到反应混合液。

（2）反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质,缓冲液采用pH为7.2的0.01M磷酸盐缓冲液，得到偶联物。

（3）按照步骤1和步骤2的方法，反应体系缺失去甲肾上腺素，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。

（4）采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、去甲肾上腺素标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到去甲肾上腺素完全抗原。

2.如权利要求1所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。

3.如权利要求1或2所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，将去甲肾上腺素与载体分别溶于1.2mol/L NaAc溶液中,分别制备34mmoL/L去甲肾上腺素溶液和3.4mmol/L载体溶液，按照去甲肾上腺素与载体摩尔比10-20：1的比例，将去甲肾上腺素溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用1.2mol/L NaAc溶液调节pH值在6.0-6.5之间，4℃持续搅拌，反应20－28小时，得到反应混合液。

4.如权利要求3所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分 。

5.如权利要求3所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，搅拌速度为 100-150转/分，滴加速度为 1-2毫升/分。

6.一种测定去甲肾上腺素完全抗原中去甲肾上腺素与载体的偶联摩尔比的方法，其特征在于，通过摩尔消光系数法计算去甲肾上腺素完全抗原中去甲肾上腺素与载体的偶联摩尔比，首先，采用紫外分光光度扫描得到去甲肾上腺素完全抗原在200-500nm之间两个特征吸收峰为λ1和λ2，其中λ1为载体的特征吸收峰，λ2为去甲肾上腺素完全抗原特有的吸收峰，公式如下：

[A_{去甲肾上腺素完全抗原λ1}/ ?_{去甲肾上腺素λ2}]/[( A_{去甲肾上腺素完全抗原λ1}- A_{去甲肾上腺素完全抗原λ2}×?_{去甲肾上腺素λ1}/ ?_{去甲肾上腺素λ2})/ ?_载体λ1]

其中，

A_{去甲肾上腺素完全抗原λ2}：去甲肾上腺素完全抗原在λ2的吸光度；

A_{去甲肾上腺素完全抗原λ1}：去甲肾上腺素完全抗原在λ1的吸光度；

?_{去甲肾上腺素λ2}：去甲肾上腺素在λ2处的摩尔消光系数；

?_{去甲肾上腺素λ1}：去甲肾上腺素在λ1处的摩尔消光系数；

?_载体λ2：载体在λ2处的摩尔消光系数；

?_载体λ1：载体在λ1处的摩尔消光系数。