[发明专利]去甲肾上腺素完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体的是说一种去甲肾上腺素（以下简称NE）完全抗原的制备方法以及测定去甲肾上腺素完全抗原中NE与载体的偶联摩尔比的方法。

技术背景

去甲肾上腺素（Norepinephrine，也称Noradrenaline，缩写NE或NA），旧称“正肾上腺素”，学名1-(3,4-二羟苯基)-2-氨基乙醇，是肾上腺素去掉 N-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。它既是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，是后者释放的主要递质;也是一种激素，由肾上腺髓质合成和分泌，但含量较少。

多巴、多巴胺、肾上腺素与去甲肾上腺素等统称为儿茶酚胺类物质，它们都是由酪氨酸衍生而来的系列物。儿茶酚胺作为神经递质和激素，与人们的健康与疾病有密切关系，它们不仅直接参与行为活动以及参与血压、心率、呼吸和睡眠等植物神经功能的调控，而且还与一些功能性疾病如神经分裂症、忧郁症以及器质性病变的出现有关。血浆及尿中儿茶酚胺的浓度水平可用于诊断高血压、嗜铬细胞瘤及成神经细胞瘤等病症,因而准确测定人体生物样品中儿茶酚胺类物质代谢浓度的变化,在疾病的诊断和治疗中具有重要的意义。目前,人体液和组织中儿茶酚胺类物质的不同分析方法,包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、电化学法、化学发光法、荧光光度法等。

NE的免疫学检测方法不仅方法简便，成本低廉，不需要高精密的仪器，而且检测的灵敏度都不亚于高效液相色谱法；但建立高效免疫学检测方法的关键是需要高品质的抗体，高品质抗体的前提是制备免疫原型较强的完全抗原，而众所周知，NE是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体，因此，研究人员需要提供一种简单可靠的方法，以获得一种能够高效激发动物机体产生抗体的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于NE的免疫学检测方法的免疫原型强的完全抗原。

技术方案包括下述步骤，

（1）将NE与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节pH值在6.0－6.5（优选6）之间，4℃持续搅拌下进行偶联反应20－28小时（优选24小时），得到反应混合液。

（2）反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质,缓冲液采用pH为7.2的0.01M磷酸盐缓冲液（PBS），得到偶联物。

（3）按照步骤（1）和步骤（2）的方法，反应体系缺失NE，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。

（4）采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照蛋白浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到NE完全抗原。

所述步骤（1）中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。

所述步骤（1）中，将NE与载体分别溶于1.2mol/L NaAc溶液中,分别制备34mmoL/L NE溶液和3.4mmoL/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比10-20：1（优选10：1）的比例，将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用1.2mol/L NaAc溶液调节pH值在6.0-6.5之间，4℃持续搅拌，反应20－28小时，得到反应混合液。

所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分。

所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，搅拌速度为100-150转/分，滴加速度为1-2毫升/分。

通过摩尔消光系数法计算NE完全抗原中NE与蛋白载体的偶联摩尔比，首先，采用紫外分光光度扫描得到NE完全抗原在200-500nm之间两个特征吸收峰为λ1和λ2，其中λ1为载体的特征吸收峰，λ2为NE完全抗原特有的吸收峰，公式如下：

[A _{NE完全抗原λ1}/ ?_NEλ2]/[( A_{NE完全抗原λ1}- A_{NE完全抗原λ2}×?_NEλ1/ ?_NEλ2)/ ?_载体λ1]