[发明专利]一种地黄组培快繁方法

说明书

技术领域

      本发明涉及一种地黄组培快繁方法。

背景技术

　地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)是玄参科多年生草本植物，主要分布于我国河北、河南、山东、山西、江苏、湖北等省区，在日本、朝鲜等地也见地黄栽培品种。地黄在我国已有1500年的栽培历史，是最早进行栽培的药用植物之一。其中尤以河南的怀地黄“处后天下之中，名产地黄，河南地厚水浮，得中央湿土之气而生内含润泽”，品质最优，经各种炮制方法入药后药效奇佳，素有“怀参”之称，是我国著名的“四大怀药”之一，也是我国中医药体系中最为常用的中药材之一。

但地黄却存在着非常严重的连作障碍（或复种连作）问题，其忌地年限需8-10年，即种植一茬地黄需要间隔约8-10年的时间方能再种。且地黄为高度的杂合体, 亲本自交不亲和，其杂交后所产子代会出现严重性状分离，又由于地黄种子繁殖幼苗生长矮小不能进行正常膨大，所以长期以来均以地黄块根为材料，进行倒栽留种的无性繁殖。但经过多代留种栽培后，块根作为靠营养繁殖材料极易遭受病毒侵染，易感染细菌和真菌病害，在多种自然因素的影响下导致地黄表现出更为严重的连作障碍问题，严重制约了地黄产业的生产和发展。

近年来，地黄的离体培养及快速繁殖体系的研究逐渐增多，逐步建立高效的再生系统，从一定程度上能缓解地黄品种退化问题，而且通过诱导地黄叶片、块根、顶芽等组织作为外殖体材料，获得脱病毒植株是规避地黄病毒病的有效途径。但传统的地黄组织培养方法需经过脱分化形成愈伤组织，再分化诱导成苗后，经生根诱导和炼苗移栽后才可成活，所用步骤较为繁琐，传统地黄组培方法培获得的幼苗生长脆弱，移栽后成活率低。

传统地黄组织培养所用外殖体材料多用地黄叶片、块根、顶芽，虽然取材容易，但操作时外殖体的消毒较为复杂，不易控制消毒时间。消毒时间过长，虽然污染率降低，但不利于芽的无菌萌发，缩短消毒时间则会导致外殖体材料的污染率加大。 

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种以地黄根生芽为外植体材料的地黄组培快繁方法，能简化组织培养操作过程，降低组织培养成本。

本发明采取的技术方案如下：

本发明提供的一种地黄组培快繁方法，包括下列步骤：

（1）采集地黄块根，用自来水冲洗干净后，于暗室培养，待块根上芽眼长出新芽，将新芽由块根上切下；经消毒、无菌水冲洗，保留新芽顶端长度为0.5-1厘米，获得根生芽作为地黄外殖体材料；

（2）将根生芽接种于成苗诱导培养基上，置入25±2℃培养室中进行成苗诱导；

（3）将诱导成苗后的地黄幼苗带叶切成小段，接种于丛生苗快繁培养基上培养，获得丛生苗；

（4）取带有2个茎节的丛生苗接种于MS生根培养基中，进行生根诱导；

（5）挑选长势旺盛的生根苗，经炼苗培养或不经过炼苗直接将生长健壮的小苗取出，自来水冲洗根部琼脂后，用0.1%的多菌灵溶液浸泡消毒后，移栽于基质中保湿培养。

所述步骤（1）的消毒，其具体操作为：先用 75 %酒精消毒25-35秒，无菌水冲洗两遍，再用0. 05 %的HgCL₂溶液消毒8-10分钟，无菌水冲洗三遍。

所述步骤（2）成苗诱导培养基为MS+6-BA 0.8-1.2 mg/L+NAA 0.05-0.12g/L；成苗诱导的条件为：每日光照时间12-13h，光照强度为4.17 ± 0.18×10³ lux。

所述步骤（3）丛生苗快繁培养基为MS+6-BA 0.2-0.4 mg/L +NAA 0.1-0.3mg/L。

所述步骤（4）MS生根培养基为MS+ PP₃₃₃ 0.1 -0.3 mg/L。

众所周知，组织培养的首要步骤是筛选外殖体材料，适宜的外殖体材料不仅能有利于消毒过程的简化，提高成苗诱导效率，还能为后续快繁过程培育出生长良好的丛生苗材料。

本发明以地黄根生芽为外殖体材料，与地黄块根相比，根生芽在暗处出芽后生长较快、出芽较长、暴露于空气的时间较短，有利于消毒处理。同样消毒时间处理后，出芽率与被污染率均优于地黄块根和地黄顶芽。优化后的成苗诱导培养基可以在较短时间内获得地黄无菌苗，不必像以地黄叶片作为外殖体需经过脱分化诱导愈伤后才可诱导成苗。因此本发明所优选的地黄块根在暗处萌发后的根生芽可作为地黄组织培养的良好外殖体材料。