[发明专利]α-葡聚糖酶和工程菌及应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化和基因工程领域，更具体地，涉及一种细丽毛壳α-葡聚糖酶的纯化工艺，一种细丽毛壳α-葡聚糖酶的基因克隆和基因工程菌的构建。 

背景技术

α-葡聚糖是一种由α-D吡喃葡萄糖单体通过(1-6)，(1-3)等糖苷键形式连接而成的多糖，多为右旋糖苷。不同类型糖苷键所占比例随不同的α-葡聚糖而变化。在医药工业中，分子量20KD，40KD，70KD的低聚α-葡聚糖是优良的血浆代用品，在临床上用于治疗失血性休克等，具有增加血容量，改善微循环等作用。α-葡聚糖是许多致病链球菌胞外多糖的重要成分，与龋齿的发生，致病菌的粘附，能量代谢，抵抗抗菌类药物渗透等过程息息相关。在制糖工业中，α-葡聚糖是微生物(如肠膜明串珠菌，链球菌属等)在感染甘蔗的过程中形成的。这些微生物能够分泌葡聚糖蔗糖酶，催化蔗糖生成葡萄糖并聚合而成α-葡聚糖。在蔗汁中葡聚糖浓度可高达1％，严重的会生成白色的固体状物质(俗称“蔗饭”)。α-葡聚糖的存在严重影响从糖汁澄清到糖的精炼等一系列工艺流程。例如糖分的直接损失；虚高糖分旋光度造成物料衡算的困难，进而影响生产；严重增加糖液的粘度致使澄清，过滤和输送等过程困难；与蔗糖共结晶致使产品纯度不高；糖晶异常，适用性差，无法在饮料等高端领域中使用等。α-葡聚糖酶是可降解α-葡聚糖成低聚葡聚糖或葡萄糖的一类酶的总称。α-葡聚糖酶的应用主要集中在生产药用低聚右旋糖酐，增强抗菌类药物的疗效，预防牙菌斑的形成，防止蔗糖转化为α-葡聚糖，从而缓解α-葡聚糖在制糖过程中的负面影响等方面。 

α-葡聚糖酶普遍存在于微生物中，具有多种类型和功能，部分品种已实现了工业化生产。其中青霉，毛壳菌等真菌来源的α-葡聚糖酶被认为是工业适用性状最好最高效的。诺维信，杰能科和Sankyo等公司已经开发了α-葡聚糖酶酶制剂产品并且进行了大量的应用研究。为了满足我国制糖行业可持续发展的要求，实现制糖工艺的清洁，节能和环保，α-葡聚糖酶的研究开发亟待进行。基于现有的α-葡聚糖酶研究，毛壳菌来源的α-葡聚糖酶的应用效果最为理想，但是在蛋白数据库中一直没有相关的序列报道。因此，获取毛壳菌来源α-葡聚糖酶的基因或是蛋白序列，才有可能构建基因工程菌，为该酶的开发利用奠定基础。 

发明内容

在对α-葡聚糖酶的研究过程中，本申请的发明人发现细丽毛壳(chaetomium gracile)具有 很好的α-葡聚糖酶活性。通过蛋白纯化技术，成功分离得到一种电泳纯的α-葡聚糖酶。通过基因克隆技术，成功克隆到一种α-葡聚糖酶基因。测序比对发现该α-葡聚糖酶基因尚未被NCBI等数据库收录，为一新发现的基因。因此，本发明的目的之一在于提供细丽毛壳来源的一种α-葡聚糖酶的分离纯化方法；目的之二是提供细丽毛壳来源的一种α-葡聚糖酶的基因；目的之三是提供包括该α-葡聚糖酶的表达载体和利用该载体构建的重组基因工程菌株。 

本发明蛋白纯化采用的技术方案是：采用Potato dextran培养基进行细丽毛壳的产酶发酵。发酵结束后，收集发酵液上清，硫酸铵沉淀，透析，DEAE-sepharose fast flow阴离子交换柱层析，SDS-PAGE检测。 

本发明基因克隆采用的技术方案是：提取细丽毛壳的基因组，根据α-葡聚糖酶的保守序列设计引物，通过PCR扩增得到细丽毛壳葡聚糖酶的部分序列，再根据该序列设计数对特异性引物，应用基因走读技术，扩增得到两侧序列。分析两侧序列，再设计引物扩增得到α-葡聚糖酶的完整基因序列(如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NI：2所示)。当然，如本领域的技术人员所知，本发明的α-葡聚糖酶基因还可以是编码由序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本发明的α-葡聚糖酶不仅仅是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。