[发明专利]一种microRNA定量检测方法

权利要求书

1.一种miRNA定量检测方法，包括如下步骤：

（1）提取样本的总RNA；

（2）用polyA聚合酶处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；

（3）用5’端含有接头序列的oligo(dT)反转录引物进行反转录，使得到的第一链cDNA加上一段接头；

（4）使用待测miRNA序列特异性正向引物和与所述接头序列互补的通用反向引物进行定量实时PCR扩增；

其中，所述通用反向引物是长度不同的两种反向引物的混合物；长反向引物由3’部分和5’部分组成，其中，3’部分与步骤（3）中反转录得到的第一链cDNA的接头5’端的部分序列互补，5’部分不与所述第一链cDNA的接头互补；短反向引物是长反向引物的片段，其缺少长反向引物3’端的部分序列。

2.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中在步骤（1）中，提取样本总RNA之前先在样本中加入External Control-1，以监控样本中RNA的提取质量。

3.根据权利要求2所述的miRNA定量检测方法，其中所述External Control-1的序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中在步骤（2）中，加polyA反应体系中加入External Control-2，以监控miRNA的加尾及反转录质量。

5.根据权利要求4所述的miRNA定量检测方法，其中所述External Control-2的序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（3）中，所述接头序列如SEQ ID NO：3所示。

7.根据权利要求6所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（3）中，所述反转录引物序列如SEQ ID NO：4所示。

8.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（4）中，所述短反向引物和长反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。

9.根据权利要求1-8任一项所述的miRNA定量检测方法，还包括如下步骤：

（5）测定定量实时PCR扩增过程中样本中待测miRNA及两种External Control的Ct值；

（6）以2^-ΔCt的方式表示样本中待测miRNA的水平，其中ΔCt为待测miRNA与External Control-1的Ct值之差。