[发明专利]一种microRNA定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体来说是一种microRNA三步定量检测方法。该方法主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测和microRNA相关药物研究以及筛选。

背景技术

microRNA（miRNA）是一类长度约为20-24个核苷酸（nt）的具有调控功能的非编码RNA。miRNA主要参与基因转录后水平的调控。miRNA基因首先在细胞核内转录成前体转录本（primary transcripts miRNA，pri-miRNA），在一种核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成约60-70nt的miRNA前体（pre-miRNA）；转运到细胞质后，另一种核糖核酸酶Dicer将其剪切成约为22nt的miRNA:miRNA双链。这种双链miRNA很快被引导进入RNA诱导沉默复合体（RISC）中，其中一条单链miRNA被降解，另一条成熟的单链miRNA分子通过与靶基因互补配对而促进其降解或抑制其翻译。相同的miRNA分子在不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间具有相似的调控功能，因此其具有保守性。但不同组织器官、不同细胞以及细胞发育的不同阶段，其miRNA的表达谱并不相同。这一细胞及“时空”特异性使其可以作为某些组织器官、不同细胞以及细胞发育不同阶段的特异性分子标志。miRNA已经成为近年来的研究热点，利用芯片及qPCR技术可以对其定量并分析。

目前采用qPCR技术对miRNA进行定量检测的方法主要有三种：(1)在常规引物延伸技术（PE）的基础上建立的引物延伸定量PCR法（PE-qPCR），即先通过一个加尾的miRNA特异性引物（GSP）将miRNA反转录成加尾cDNA，然后利用一个锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）修饰的miRNA特异性反向引物（RP）和一个与加尾序列一致的通用引物（UP）进行PCR扩增。由于在DNA转录过程中，miRNA的3’端序列产生的多样化现象，使得目前市场上qPCR两步检测法的准确性受到很大影响。(2)利用茎-环状引物反转录miRNA，称为stem-loop RT-qPCR检测法，茎-环状反转录引物中除含有一段与miRNA互补的特异性序列外，还含有一段较长的共有序列，与靶miRNA退火反转录后，能得到一个较长的反转录扩增子（cDNA），共有序列提供了一个通用引物结合位点，然后通过一个与miRNA序列特异的引物和一个通用引物进行PCR扩增。深度测序结果表明，miRNA的3’末端多发生降解，茎环结构反转录引物扩增中存在潜在的扩增灵敏度问题。(3)三步检测法，先用polyA聚合酶（PAP）处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴，然后用5’端含有接头序列的polyT引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，为随后的PCR扩增提供通用反向引物序列，再利用一条miRNA序列特异性正向引物就可实现PCR扩增。然而，常规三步检测法的特异性和灵敏度都相对较差。

发明内容

为了克服现有技术中miRNA定量检测方法存在的问题，本发明对常规的miRNA三步定量检测法进行了改进，建立了一种新的miRNA三步定量检测法，该方法可以对miRNA的表达进行定量检测和分析，大大提高了现有检测方法的特异性、灵敏性和重复性。

发明人分析了miRNA数据库中的1600多条人类miRNA和900多条小鼠的miRNA序列后设计了独特的接头序列，其序列不与库中的任意一条miRNA发生错配或形成二聚体，在提高检测灵敏性的同时保证了扩增的特异性。另一方面，反向引物还采取了双引物混搭的特殊设计，长度不同的两条反向引物均能够以加尾反转录处理得到的带有接头序列的cDNA为模板进行扩增，长引物充分保证扩增的特异性，短引物则大大提高扩增的灵敏性。

本发明提供了一种miRNA定量检测方法，包括如下步骤：

（1）提取样本的总RNA；

（2）用polyA聚合酶处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；

（3）用5’端含有接头序列的oligo(dT)反转录引物进行反转录，使得到的第一链cDNA加上一段接头；

（4）使用待测miRNA序列特异性正向引物和与所述接头序列互补的通用反向引物进行定量实时PCR扩增；

其中，所述通用反向引物是长度不同的两种反向引物的混合物；长反向引物由3’部分和5’部分组成，其中，3’部分与步骤（3）中反转录得到的第一链cDNA的接头5’端的部分序列互补，5’部分不与所述第一链cDNA的接头互补；短反向引物是长反向引物的片段，其缺少长反向引物3’端的部分序列。