[发明专利]含有乙脑E蛋白C末端中和表位基因的融合蛋白及其疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，尤其涉及一种含有乙脑E蛋白C末端中和表位基因的融合蛋白及其疫苗。

背景技术

猪是乙脑主要的传染源之一，它与蚊形成了“蚊、猪”的循环传播模式。同时，乙脑也是严重危害养猪业的重大疫病之一，该病引起妊娠母猪流产和死胎，公猪发生睾丸炎，仔猪因脑炎病死，直接影响猪群数量的扩大，给养猪业的持续高产发展造成了巨大的经济损失，并极大的限制了肉产品的出口创汇；在我国目前用于猪乙脑治疗的疫苗是BHK细胞上培养的弱毒苗，但是存在病毒滴度低，保持能力不佳等缺点，所以对研制乙脑基因工程疫苗的要求越来越迫切；乙脑病毒的结构蛋白有C、PrM/M和E蛋白三种。E蛋白是病毒的包膜蛋白，含有病毒的抗原决定簇，由500个aa残基组成，分子量为53kDa。E蛋白是疏水性的，富含有甘氨酸和丙氨酸，仅有一个糖基化位点(Asn154-X-Ser)。E蛋白是毒粒表面的重要成份，由它形成的表面抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。E蛋白C末端的中和表位位于E蛋白上373aa-399aa，共27个氨基酸，已研究发现，用该表位的原核表达产物免疫小鼠后，其中和抗体滴度虽然比疫苗或亚病毒颗粒免疫后的滴度低，但是从中和表位免疫小鼠以及疫苗免疫后的中和抗体滴度与ELISA抗体滴度的比值进行比较，表明该中和表位具有很大的潜力，并且在六种毒株(JaOArS982，Nakayama，Bei jing-1，Kamiyama，691004和Muar)之间该部位相当保守，同源性达到85%-100%。

发明内容

针对现有技术中存在的治疗猪乙脑的疫苗病毒滴度低，保持能力不佳的缺陷，本发明提供了一种含有乙脑E蛋白C末端中和表位基因的融合蛋白及其疫苗，本发明的疫苗中和抗体效价高于弱毒苗，足以保护强毒的攻击。

本发明提供了一种分离的乙脑E蛋白C末端的中和表位基因，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种上述基因编码的分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种融合蛋白，由乙脑E蛋白C末端的中和表位基因和M.T hsp70基因构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种编码上述融合蛋白的基因，其基因序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种载体，含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的基因序列。

本发明还提供了一种工程菌，含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的基因序列。

进一步的，所述的载体的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，上述载体表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种用于预防乙脑的疫苗，含有上述的蛋白。

本发明还提供了一种用于预防乙脑的疫苗，含有上述的工程菌。

本发明还提供了上述的载体的制备方法，包括一个人工合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因的步骤，一个将中和表位基因克隆到原核表达载体上的步骤，一个扩增hsp70基因的步骤，一个将hsp70基因克隆入原核表达载体中中和表位基因下游，得到融合蛋白表达载体的步骤，一个将融合蛋白表达载体在大肠杆菌中的表达的步骤，一个将表达的蛋白纯化的步骤。

进一步的，在一个人工合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因的步骤中，以SEQ ID NO：7所示的序列为正义链，以SEQ ID NO：8所示的序列为反义链，合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因。

进一步的，在一个将中和表位基因克隆到原核表达载体上的步骤中，将中和表位基因以EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切后，克隆到原核表达载体pET-32a（+）上，构建表达载体pet-32a-epitope。

进一步的，在一个扩增出hsp70基因的步骤中，以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板，扩增出hsp70基因，扩增M.T hsp70的上游引物序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物序列如SEQ ID NO：10所示。