[发明专利]多血清型口蹄疫病毒3C基因特异性siRNA筛选与应用

说明书

技术领域

本发明属口蹄疫生物防治技术领域，具体涉及针对多血清型(O型、A型和Asia I型)口蹄疫病毒3C基因保守区分析，及可靶向特异性抑制三种血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA筛选及验证。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)引起的一种致偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病，国际兽医局(OIE)将其列为A类传染病之首，该病宿主广泛，其中对猪、牛等家养偶蹄动物危害最为严重。FMD在世界范围内多次发生大流行，屡次重创世界畜牧经济，因此素有“政治经济病”之称。世界各国在预FMD流行中投入了大量人力、物力，建立了包括动物捕杀，疫苗接种及流行病学监测等预防手段在内一套严密的防控体系，但目前仍无法有效控制FMD的发生与流行，其根本原因在于FMDV血清型、血清亚型众多(七种血清型及65种以上的血清亚型)，各血清型/亚型间交叉免疫原性差，无法提供有效的保护力。另外FMDV属于小RNA病毒，其基因组突变率高，病毒流行株更迭迅速，可快速摆脱疫苗株抗体的抑制。因此研制出具有广谱、高效抗FMDV作用的新型抗病毒制剂，以扭转FMD防控的不利局面具有重要的理论意义与实际价值。

上世纪末发现的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术通过特异性地与目标基因mRNA形成二聚体，可加速成熟mRNA的降解，有效抑制目标基因的翻译，导致目标基因的表达沉默，从而抑制目标基因功能。目前RNA干扰技术已经发展成为高效、特异性阻断细胞内目标基因表达来研究基因功能的有效工具。采用RNAi技术在治疗癌症及烈性病毒性传染病，诸如HBV、HCV、HIV、SARS和流感等方面的研究成果丰硕，且效果明显。RNAi技术有望生产出有效治疗疾病的特异性药物，应用前景光明。应用RNAi技术用于抑制FMDV复制增殖等研究亦有相关报道，均能取得良好的抑毒效果。但距离应用临床FMD防治还存在较大差距，其原因主要在于FMDV的多血清型/亚型之间基因组的高变性。由于RNAi技术中起到降解mRNA作用的siRNA需要与靶序列精确结合，存在过多的突变位点会减低mRNA的降解效率，某血清型口蹄疫特定分离株特性性siRNA，由于其他分离株在靶序列位置存在基因多态性的原因，该siRNA对其他与目标分离株靶序列比较多态性差异加大的分离株并不能获得良好的抑制效果，这严重限制了siRNA作用的口蹄疫病毒谱系范围。研究表明FMDV基因组存在高突变性，但高突变位点主要集中于编码FMDV抗原表位等结构蛋白基因，而非结构蛋白相对较为保守，同时考虑到非结构蛋白在病毒核酸复制、病毒蛋白裂解等过程的关键性作用，抑制非结构蛋白则更能高效地抑制病毒增殖。设计靶位于多血清型/亚型口蹄疫病毒非结构蛋白基因共同高度保守区的siRNA更容易实现RNAi的病毒谱系的广泛性和高效性，有利于加快RNAi技术在临床的应用。

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3C编码病毒的一种蛋白酶，能单独发挥作用，具有催化病毒聚合蛋白裂解和宿主蛋白裂解的作用。3C可以催化聚蛋白的次级裂解，在P1、P2和P3内发挥裂解作用。3C蛋白的表达下降，将有效抑制FMDV病毒衣壳蛋白的裂解，降低病毒粒子的包装及释放效率，从而抑制FMDV的复制。研究表明不同血清型FMDV分离株3C基因高度保守，同源性在78％以上，为针对不同血清型FMDV分离株3C基因保守区设计特异性siRNA，达到抑制多血清型FMDV复制目的奠定基础。

我国处于欧亚大陆东端，陆路与十几个国家接壤，周边国家口蹄疫地理分布极为复杂，使得我国面临口蹄疫的严重威胁。目前在国内发现及造成较大危害的口蹄疫主要为O型、A型和Asia I型口蹄疫。我国幅员辽阔，自然气候条件多样，各省地口蹄疫病毒流行株差异较大，使得FMD的防控形势异常严峻。

发明内容

本发明目的是利用RNAi技术，针对多血清型(O型、A型和AsiaI型)口蹄疫病毒3C基因高保守区设计合成siRNA，提供能够广谱、高效抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA，为口蹄疫病毒防治提供新的策略。