[发明专利]一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及纤维素酶活力测定方法，具体说是一种羧甲基纤维素酶活力(CMCNa-DNS)的测定方法。 

背景技术

纤维素酶(Cellulase)是一种多组分的复合酶，不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异。一般来讲，纤维素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1，4-glucanase，E C3.2.1.91)、内切β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1，4-glucanase，E C3.2.1.4)和纤维二糖酶(Cellobiase，E C3.2.1.21)。不同来源的纤维素酶制剂产品中三种酶组分含量的比例不同，因此其最终的表观酶活力会有差异。同时纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活力的测定方法很多，且方法复杂而不统一。常用的方法有：羧甲基纤维素糖化力法、羧甲基纤维素液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。上述测定方法中，羧甲基纤维素糖化力主要代表外切β-1，4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和，在研究和实际生产中应用比较普遍。 

国内外采用羧甲基纤维素糖化法测定纤维素酶活力的方法很多。目前，国际上有较公认的IPUAC推荐的纤维素酶测定方法(T.K.GHOSE，1987)，该方法分别对来自三个厂家(Primfast CL购自杰能科公司，Cellusoft L购自诺维信公司，A5为本公司自主研发产品)纤维素酶进行多次检测，其变异系数达2％以上。造成较大误差 的原因可能是加入的羧甲基纤维素钠浓度高和粘度大，容易在操作过程中带来较大误差，且该方法反应时间为30分钟，利用比色管显色后需稀释用分光光度计检测吸光度值，整个操作繁琐且耗时；另外，该方法DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂配制未经定容，从而造成批次间测定结果存在较大差异。 

发明内容

本发明为了解决现有技术中存在的测定过程复杂，测定不准确的问题，提供一种新的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，采用本发明的方法，测定过程简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。 

本发明是采用如下技术方案实现的： 

一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，包括如下步骤： 

（1）猴头菌培养物溶液的制备：猴头菌培养物经粉碎，过筛，以适量水溶解，振摇2~4小时，滤过，定容。 

（2）吸光度测定：精密量取1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置具塞刻度试管中，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，置45~55℃水浴中保温25~35分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时，以空白管进行调零，在540nm波长处测定吸光度。空白管加1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml，置45~55℃水浴中保温25~35分钟，取出，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分 钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时。 

（3）计算羧甲基纤维素酶活力：从葡萄糖标准曲线上读出猴头菌培养物溶液中还原糖的重量（mg），按照下式计算羧甲基纤维素酶活力： 

U=A×1/0.5×n×2 

式中 U——每1g含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g； 

A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖重量，mg； 

n——样品稀释倍数； 

2——时间换算系数。 

1g固体酶在50±1℃、pH4.8条件下，1小时水解1%羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示。 

上述的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其中步骤（3）所述的葡萄糖标准曲线测绘方法为：分别精密量取0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0mg/ml的葡萄糖对照品溶液1.5ml，置具塞刻度试管中，各精密加pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时，以相应的试剂为空白，在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。 

上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述具塞刻度试管容积为25ml。 

上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述猴头菌培养物溶液为8~10 mg/ml，且临用新制。