[发明专利]一种制备环孢素A完全抗原的方法无效
申请号: | 201210155951.7 | 申请日: | 2012-05-18 |
公开(公告)号: | CN103421187A | 公开(公告)日: | 2013-12-04 |
发明(设计)人: | 于丽秀;华小黎;陈东生;吕永宁;蔡雪峰;伍三兰;宋丽丽;廖婧 | 申请(专利权)人: | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 |
主分类号: | C08G69/48 | 分类号: | C08G69/48 |
代理公司: | 武汉楚天专利事务所 42113 | 代理人: | 雷速 |
地址: | 430022 湖北*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 制备 环孢素 完全 抗原 方法 | ||
1.一种制备环孢素A完全抗原的方法,包括以下步骤:
步骤一:以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源,以叔丁醇作为反应溶剂,在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸(BBa)和CsA的加成反应,得到中间体CsA不完全抗原(CsA-BBa);
步骤二:将CsA不完全抗原(CsA-BBa)溶于二甲基甲酰胺中,再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸(PL)反应,生成环孢素A完全抗原。
2.根据权利要求1所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤一所述的以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源,以叔丁醇作为反应溶剂,在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸(BBa)和CsA的加成反应,得到中间体CsA不完全抗原(CsA-BBa)的具体方法包括以下步骤:
步骤1:将CsA与4-苯甲酰苯甲酸(BBa)按摩尔比为1:1.0-1:1.2的比例装入石英比色皿(容量为14mL)中,用移液管加入10mL叔丁醇,超声3min使CsA和4-苯甲酰苯甲酸(BBa)充分溶解;
步骤2:向步骤1中的石英比色皿中通入氮气鼓泡30±10min后,以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源进行光照,紫外光源距比色皿10±2cm,同时缓慢滴加叔丁醇,并记录反应时间,反应过程中持续通入氮气,反应2.5±0.5h后停止光照,并停止滴加叔丁醇,结束光化学反应,得到淡黄色液体产物1;
步骤3:用CHCL3与CH3OH的体积比为85:15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离,得到无色固体粉末状产物2,该无色固体粉末状产物2即为CsA不完全抗原(CsA-BBa)。
3.根据权利要求1所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤二所述的将CsA不完全抗原(CsA-BBa)溶于二甲基甲酰胺中,再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸(PL)反应,生成环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤:
步骤a:称取4.5mg聚-L-赖氨酸(PL)溶于0.5mL水中,配制成聚-L-赖氨酸的水溶液,浓度为90%;称取15.0mg步骤三中得到的无色固体粉末状产物2溶于0.7mL的二甲基甲酰胺中,配制成无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液;于恒温25℃搅拌的条件下,将配制好的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液滴加到配制好的聚L-赖氨酸水溶液中,得到无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸的混合液,再用10%的NaOH溶液将得到的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸混合液的pH调至中性;
步骤b:采用偶联反应制备环孢素A完全抗原:将步骤四得到的混合液搅拌反应过夜,并在搅拌反应过程中分五次加入60mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI),每次间隔1±0.5h,加液同时调节混合液的pH值始终保持在6-7之间,得到产物3;
步骤c:用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到无色固体粉末产物4,该产物4即为环孢素A完全抗原。
4.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤1中CsA与4-苯甲酰苯甲酸(BBa)的摩尔比为1:1.1。
5.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤1中所述的石英比色皿的容量为14mL。
6.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤3所述的用CHCL3与CH3OH的体积比为85:15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离,得到无色固体粉末状产物2的具体方法是:将步骤2中光化学反应后得到的产物1在10×20cm的荧光薄层层析板采用CHCL3/CH3OH=85/15(体积比)的二元展开体系展开,1.5h后取出层析板,将层析板置于通风橱中挥发至干,在254nm紫外灯下显色,刮下比移值Rf为0.60的颜色较深的硅胶合并,用3×10mL的无水甲醇洗提,4000r离心分离10min,合并上层清液,再离心10min,得到澄清洗涤液,洗涤液在减压下旋转蒸干,得到无色固体粉末状产物2。
7.根据权利要求3所述的制备环孢素A完全抗原的方法,其特征在于,步骤c中用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤:
a.透析袋的处理:用电子天平称取84mg NaHCO3于100mL蒸馏水中,配成10mmol/L NaHCO3溶液;用电子天平称取372.24mg Na2EDTA于100mL蒸馏水中,配成10mmol/L Na2EDTA溶液;剪取长度为20±5cm透析膜,在过量的上述NaHCO3溶液中浸湿并煮沸10min,再浸入上述Na2EDTA中煮沸10min,取出用蒸馏水反复浸洗三次以彻底去除杂质,将处理后的透析袋浸入95%乙醇溶液中贮存备用;
b.透析缓冲液的配制:取硼酸1.6g,Tris3.0g,Na2EDTA0.4g,NaC12.9g,加入100ml蒸馏水,水浴保温使之充分溶解,再加入2-巯基乙醇7μL,振荡混匀即得10xTBN缓冲液(pH=8.5);使用时将此母液稀释10倍即得1xTBN缓冲液,再与甲醇3:2(体积比)混合,即得所需的缓冲液;
c.透析操作:将处理好的透析袋取出,用蒸馏水漂洗,将其一端用棉线扎紧,充满水后进行挤压试漏,确定透析袋完整无漏液后,用移液管将偶联终产物转移入透析袋,用棉线将另一端扎紧,透析袋置于约150mL上述缓冲液中,持续轻微搅拌,3.5±0.5h换液,共5次;取出透析袋,用移液管吸出透析液并定体积,浓缩减压干燥后得到无色固体粉末产物4,该产物4即为环孢素A完全抗原。
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