[发明专利]一种制备环孢素A完全抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与药学领域，具体涉及制备环孢素A抗原的方法。

背景技术

环孢素A(CsA)作为器官移植的主要免疫抑制药物，在器官移植的某些领域有着不可替代的作用，可以有效提高移植器官存活时间。但其治疗窗口窄、生物利用度和药代动力学个体差异较大，而且机体对CsA的敏感性和耐受性也存在一定差异。因此，必须长期对患者进行血药浓度监测，减少毒副作用的发生，延长移植器官存活时间。

目前，国内大多是使用美国雅培公司生产的全自动血药浓度监测仪TDxFLx进行血药浓度测定，存在的不足是它必须从美国雅培公司购买专用试剂盒，由于是独家生产，价格昂贵，给患者术后带来了很大的经济负担。部分患者因经济原因中途减少或放弃CsA血药浓度监测，从而造成患者体内CsA中毒或慢性排斥反应器官移植失败。此外，目前TDxFLx的使用多集中在三级甲等医院，患者CsA的血药浓度监测需要到这些医院才能进行药物浓度监测，给患者的用药造成了很大的不便。

CsA血药浓度监测都是基于抗原抗体特异性结合的反应原理，需要获得针对待检物的抗体，而在CsA抗体制备的过程中，环孢素A完全抗原的合成是其中至关重要的一环，环孢素A完全抗原性能的好坏直接影响到下一步CsA单克隆抗体的制备，本方法可以合成效价良好的环孢素A完全抗原。

发明内容

本发明的任务是提供一种制备环孢素A完全抗原的方法，使其具有方法简单，快捷，便于操作，并使所制备的环孢素A完全抗原与抗体反应时具备高特异性与高亲和力，即具有良好的特异性和免疫原性等特点。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种制备环孢素A完全抗原的方法，包括以下步骤：

步骤一：以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）；

步骤二：将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原。

上述步骤一所述的以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）的具体方法包括以下步骤：

步骤1：将CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）按摩尔比为1:1.0-1:1.2的比例装入石英比色皿（容量为14mL）中，用移液管加入10mL叔丁醇，超声3min使CsA和4-苯甲酰苯甲酸（BBa）充分溶解；

步骤1中CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的摩尔比具体可以为1:1.1；步骤1中所述的石英比色皿的容量具体可以为14mL。

步骤2：向步骤1中的石英比色皿中通入氮气鼓泡30±10min后，以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源进行光照，紫外光源距比色皿10±2cm，同时缓慢滴加叔丁醇，并记录反应时间，反应过程中持续通入氮气，反应2.5±0.5h后停止光照，并停止滴加叔丁醇，结束光化学反应，得到淡黄色液体产物1；

步骤3：用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2，该无色固体粉末状产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

步骤3所述的用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2的具体方法是：将步骤2中光化学反应后得到的产物1在10×20cm的荧光薄层层析板采用CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系展开，1.5h后取出层析板，将层析板置于通风橱中挥发至干，在254nm紫外灯下显色，刮下比移值Rf为0.60的颜色较深的硅胶合并，用3×10mL的无水甲醇洗提，4000r离心分离10min，合并上层清液，再离心10min，得到澄清洗涤液，洗涤液在减压下旋转蒸干，得到无色固体粉末状产物2。

上述步骤二所述的将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤：