[发明专利]重组链霉亲和素的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白制备领域，具体公开了一种重组链霉亲和素的制备工艺。

背景技术

链霉亲和素(Streptavidin，下称SA)是Streptomyces avidinii菌培养过程中的一种外分泌的蛋白质，与亲和素(Avidin)有相似生物学特性，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素：D-生物素（维生素H）。

SA为四聚体，平均每个亚基都能结合一分子生物素，Streptavidin-Biotin之间亲和力非常强，Kd值接近10¹⁵M。生物素易于与多种生物活性分子（如蛋白，核酸和糖类等）发生偶联。在发现SA之前，科学家利用生物素和亲和素的特点，利用两者亲和的能形成Avidin－Biotin系统，一方面可以偶联抗原、抗体及核酸分子,另一方面又能被酶等多种材料标记，于是此系统能够应用于抗原抗体检测作为生物反应放大系统。随SA的出现，研究者发现SA不带糖基、等电点低，且完整的四聚体还具有热稳定性好，对强酸、SDS、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，使得Streptavidin-Biotin系统与Avidin-Biotin系统相比具有亲和力高、灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测背景干扰少等优势，提高了检测灵敏性和拓宽了应用范围。SA完全代替了Avidin，形成的Streptavidin-Biotin系统，被更加广泛的应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。

1963年Stapley EO等首次发现SA，当时分离纯化获得的SA分子量约为60kDa，每个单链分子量约为15kDa。80年代研究人员发现天然SA单体肽链由169个氨基酸组成，分子量为16.5kDa，四聚体分子量为66.0kDa。早期获得的SA蛋白之所以比全长短，经研究证实是因为全长的蛋白在Streptomyces avidinii菌外分泌发酵过程中易被细胞外分泌的蛋白酶酶切，成为不完整的SA蛋白。这种不完整的SA为全长的蛋白去掉N端10-12个氨基酸残基，C端去掉19-21个氨基酸残基的片段，因为后期研究表明SA氨基酸两端的序列为疏水性序列，是降低全长蛋白溶解性的关键，它的存在也会减弱SA与生物素的亲和能力。当蛋白被分泌到菌体外时，由蛋白酶切去除这两段序列，恢复SA的溶解性，这样可以大大降低它在细胞内由于过多结合生物素照成的细胞毒性，起到保护细胞的作用。截短的SA，称为核心链霉亲和素（Core Streptavidin，CSA）具有溶解性好，生物活性、稳定性、耐酸、耐尿素及盐酸胍能力高的特点，是当前国内为主要使用的链霉亲和素形式。

1998年Anna Gallizia等运用表达载体pET11a和大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)成功地表达了带有T7标签的CSA蛋白，其表达量为70mg/L。2005年Xipeng Liu等运用表达载体pET28a和表达宿主BL21（DE3）分别表达了带有信号肽的SA和CSA，表达量都约在80mg/L左右。近年也有研究人员试图在大肠杆菌中实现外分泌表达SA，2008年Gerhard Miksch等人运用phoA基因的引导序列、相应的强启动子及kil基因构建了一个特殊的表达载体，实现了SA在大肠杆菌BL21（DE3）中大量的外分泌表达，通过表达条件的优化获得外分泌SA的产量为1715nM（109.76mg/L）。

鉴于此蛋白在生物各领域及国内外均应用广泛，而目前国内需求基本靠昂贵的国外进口满足，因此开发一种高效，成本低廉、活性较高的链霉亲和素的生产方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效，低成本，有利于大规模生产的制备重组链霉亲和素（核心链霉亲和素）的方法，以提高链霉亲和素的产量，供工业生产需要。

本发明利用基因工程的方法，人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离纯化等步骤获得重组链霉亲和素。本发明所述的重组链霉亲和素即为截短的链霉亲和素（SA），又称为核心链霉亲和素（CSA）。

本发明的技术方案为：一种重组链霉亲和素的制备工艺，具体步骤如下：

1)人工合成表达重组链霉亲和素的重组基因，所述重组基因的序列包括核心链霉亲和素（CSA）基因序列以及位于核心链霉亲和素（CSA）基因序列左右两侧的限制性酶切位点序列；

2)重组质粒的构建：将步骤1）的重组基因插入载体，获得能够表达重组链霉亲和素的重组质粒；

3)基因工程菌的制备：将步骤2）获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌；