[发明专利]单纯疱疹病毒Ⅱ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法

说明书

一、技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够防治单纯疱疹病毒II型感染所致疾病的基因重组减毒活疫苗及其制备方法。

二、背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一种经皮肤和粘膜密切接触传播的病毒，包括单纯疱疹病毒I型(简称HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(简称HSV-2)，两种病毒具有83％以上的共同基因特征，50％以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可高达80％以上，并长期潜伏于感觉神经节内，虽然大多数HSV-1感染者没有明显症状，但少数感染者可产生终生的反复发作的面口疱疹、致盲性很高的眼内眼炎以及致命性的疱疹性肺炎和疱疹脑炎。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，占生殖器疱疹原发感染的90％以上。II单纯疱疹病毒感染人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在神经节内，在机体免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其中60％-70％的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。研究表明安全套并不能有效预防疱疹病毒感染，世界范围内生殖器疱疹发病率在逐年上升，据美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病率已经上升到了16％以上，在纽约已经上升至25％以上，目前并无单纯疱疹病毒感染，尤其是复发性感染的特效治疗方法，抗病毒药物常规用药虽能缓解一些临床症状，但不能彻底清除体内潜伏的病毒，也不能减少复发次数，因此迫切需要开发能有效防治单纯疱疹病毒感染的疫苗。

近数十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。

病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，这种类型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗等在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了不可替代的作用，为人类的健康做出了不可磨灭的贡献。减毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一样的感染和复制特性，但没有致病作用，此类疫苗可以有效地诱导机体产生全面的免疫应答，相对于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好。

传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。近年来，研究者开始采用现代分子生物学技术，将HSV基因组的特定基因进行敲除以获得重组株。本发明则是利用现代分子生物学技术，以Genebank中的HSV-1和HSV-2基因组参考序列(HSV-1登录号：NC_001806，HSV-2登录号：NC_001798)为蓝本，通过联合敲除多个基因，筛选出了HSV-1型和HSV-2型重组减毒株，它们的致病能力均发生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-1和HSV-2感染所致疾病。

三、发明内容

本发明的目的是提供能够预防和治疗单纯疱疹病毒II感染所致疾病的重组减毒活疫苗及所述疫苗的制备方法。

本发明涉及的单纯疱疹病毒I型重组株或单纯疱疹病毒II型重组株，均由野生型HSV-1或野生HSV-1经过重组、筛选和纯化得来的。

所采用的技术方案是取水泡较为明显的口唇疱疹和生殖器疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型HSV-1和HSV-2；扩大培养后提取病毒完整基因组；和含有荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列的穿梭载体共同转染Vero细胞；在荧光显微镜下使用一种或者联合使用多种荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒，经过空斑纯化后可获得所需要的重组减毒活疫苗。

可以获得一种单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组中的US2、US3、US4和US5基因的HSV-2重组株。

可以获得一种如上所述的单纯疱疹病毒II型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲除了其基因组中的US2、US3、US4、US5基因和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-2重组株；所述其它复制或感染非必需基因片段是US9～US12基因，UL55与UL56到左侧RL2与RL1基因，UL43～UL47基因，或者上述三者的任意组合。