[发明专利]双组分系统基因dtrA和dtrB的用途与利用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及耐辐射异常球菌R1中一对双组分系统基因dtrA和dtrB在提高菌株热敏感性和UV辐射抗性上的用途和利用方法。

背景技术

耐辐射异常球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）具有超强的电离辐射、紫外线、DNA损伤试剂及干燥的抗性，备受各国科学家的关注和重视。如宋道军、余增亮的《耐辐射异常球菌抗辐射机理的研究新进展》中报道了各国在耐辐射异常球菌生理生化和遗传学特性、特殊的细胞膜结构、各种诱变因素所致的DNA损伤与其高效的修复机制方面的研究；基因组分析显示，耐辐射球菌R1中含有20种组氨酸激酶和26种反应调控蛋白，存在多个双组分系统，其中二号染色体上的dr_a0009（dtrA）和dr_a0010（dtrB）基因分别编码组氨酸激酶和反应调控蛋白，与枯草芽孢杆菌的同源性为40%以上。当外界或内部环境发生变化时，组氨酸激酶的传感器结构域能够感应环境的刺激并迅速二聚化，导致催化ATP依赖的特定的组氨酸残基自我磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而与下游基因的启动子或与蛋白作用，产生调控应答反应。

细胞内有一系列的信号转导途径应对外界环境刺激，其中热激和UV辐射是一种重要的逆境胁迫。热激反应是细胞和有机体应对温度升高时的一种保守反应，能保护细胞和有机体免受热损伤，使得细胞恢复正常的生理活动，从而达到一个更高的耐热性水平。热激能迅速诱导一套基因的表达，同时使细胞膜的流动性发生变化。UV辐射能够产生嘧啶二聚体，造成的DNA损伤。

目前，耐辐射异常球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）中dtrA（dr a0009，GeneID:1798204)基因和dtrB（dr a0010，Gene ID:1798154)基因对于热激反应和UV辐照的研究尚未见报道。而在发酵行业中，需要高温发酵杀死虫卵及一些有害细菌，可以提高发酵的质量，因此发酵行业对于热敏感菌株具有较大需求。紫外线（ultraviolet radiation,UV）对人体皮肤造成损伤已日益得到人们的重视，随之产生多种针对皮肤的防晒产品，在化妆品行业对抗UV辐射菌株的需求也与日俱增，因此利用基因工程研究基因在菌株热敏感性和UV辐射抗性中的应用是非常重要并具有经济价值的。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。

双组分系统基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，还包括构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤。

克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。从Deinococcus radiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。

构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株的步骤包括：

1)．用SacII酶和EcoRV酶将分别连接在载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开；

2)．插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因；

3)．通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；

4)．将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌R1中。

优选的是，所述连接dtrA和dtrB基因的载体为T载体。

进一步优选的是，所述连接dtrA基因的载体为pMD19T载体。

进一步优选的是，所述连接dtrB基因的载体为pGEM-T Easy载体。

具体将DNA片段转化到耐辐射异常球菌R1中的步骤如下：

1）挑取耐辐射异常球菌R1单菌落于TGY液体培养基中，30℃培养至对数期；

2）按1:100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30℃培养至对数期（OD₆₀₀≈0.4）；