[发明专利]一粒小麦成熟胚的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一粒小麦成熟胚的组织培养方法。

背景技术

一粒小麦(einkorn)是小麦属的二倍体种(2n=2x=14，AA)，是小麦的重要基础物种。一粒小麦具有耐寒、耐旱特性，适宜在山区栽培，对土壤要求不高，并发现其具有抗锈病的抗源。小麦为六倍体植物，具有基因组庞大、重复序列多、基因克隆困难等特点。二倍体一粒小麦较普通六倍体小麦基因组小，是进行插入诱变以分离、克隆小麦基因的良好材料。因此，建立高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系不仅能为二倍体小麦遗传转化提供参考，还能为小麦分子育种研究奠定基础。

植物组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为植物遗传转化操作的主要基础，一直受到广泛关注。到目前为止，麦类组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药、成熟胚、幼叶、子叶中层、种子、悬浮细胞、子房、茎尖、根尖分生组织和原生质体等。研究其愈伤组织分化情况，其中，幼胚被认为是最理想的外植体材料，愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因小麦植株的报道基本以幼胚为受体。而幼胚取材受时间、空间和季节的限制，合适的取材时期难以把握，所取材料生理状态、发育阶段的一致性也不能很好保障，在一定程度上制约了遗传转化的有效开展与应用。成熟胚取材方便，不受季节、植株发育阶段等因素限制，能保证不同个体间生理状态的一致性，是开展遗传转化最为方便实用的受体。目前，鲜有关于麦类二倍体物种组织培养体系建立的报道，且一粒小麦成熟胚组织培养再生体系的建立尚处于起步阶段。因此，亟待建立一种高效稳定的一粒小麦成熟胚组织培养再生体系，为研究其遗传转化提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的一粒小麦成熟胚的组织培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一粒小麦成熟胚的组织培养方法，其包括种子消毒、剥离种胚、愈伤组织诱导培养、分化培养及生根培养的步骤。

其中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I为：在基础培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和/或6-糖氨基嘌呤(KT)后制成的pH值为5.8-6.0的培养基；所述分化培养步骤中使用的培养基II为：在基础培养基中添加α-萘乙酸(NAA)、6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤(ZT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、6-糖氨基嘌呤(KT)或2-羟乙基-三甲基氢氧化胆碱(CC)中的一种或多种后制成的pH值为5.8-6.0的培养基。

所述基础培养液配方为(以水配制)：

所述基础培养液配方优选为(以水配制)：

前述方法中，所述愈伤组织诱导培养步骤中使用的培养基I中2，4-D与KT的添加比例为：2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D1-2mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D5-6mg/L+KT 0-0.05mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D1-2mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D5-6mg/L+KT 0.1-0.15mg/L、2，4-D 0.5-1mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，4-D 1-2mg/L+KT 0.5-0.6mg/L、2，4-D 3-4mg/L+KT 0.5-0.6mg/L或2，4-D 5-6mg/L+KT 0.5-0.6mg/L等。

前述方法中，所述分化培养步骤中使用的培养基II中NAA、ZT、6-BA、KT与CC的添加比例为：KT 0.5-1.0mg/L、KT 1.0-2.0mg/L、KT 2.0-3.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L+ZT 1.0-2.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+ZT 1.0-2.0mg/L或NAA 0.5-1.0mg/L+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+ZT1.0-2.0mg/L+CC 1.0-2.0mg/L等。